高效液相色谱—串联质谱法测定饲料中恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星

王洋 李媛媛 王寒冰 李滢倩 王潇

摘 要：建立饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定方法。试样用磷酸盐缓冲溶液提取，经固相萃取小柱净化，氮气吹干后用溶解待测。采用LC-MS/MS测定，色谱柱为C8反相色谱柱，流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，电喷雾正离子模式电离，多反应选择离子检测（MRM），外标法定量。结果表明方法可用于饲料中恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星的同时测定。。

关键词：饲料；液相色谱-串联质谱；恩诺沙星；环丙沙星；诺氟沙星；多反应监测 【中图分类号】TS214.2 【文献标识码】A

恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星属于喹诺酮类药物，由于其具有抗菌谱广、杀菌活性强、毒副作用小及敏感微生物的最小抑菌浓度低等优点，被广泛应用于各种动物感染性疾病的预防和治疗。但有一部分生产者将其应用到饲料产品中，起到抑菌杀菌的作用。如果动物食用这种饲料会造成一定的危害，产生耐药性或一些毒副作用。因此，建立快速准确地测定饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的方法，对于加强饲料产品监管具有重要意义。

本文建立的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）快速准确地测定饲料中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星的方法，可满足检测要求，为饲料产品监督检验提供技术依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

Agilent 1200LC/-6410B MS液相色谱/串联四极杆质谱仪（安捷伦科技有限公司）；BS224S电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；HYQ-2110液体混匀器（苏州捷美电子有限公司）；KQ-250DE超声波发生器（昆山市超声仪器有限公司）；Microfuge离心机（美国BECKMAN公司）。

恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星标准品，纯度>98%（美国SIGMA公司）；乙腈、甲酸为色谱纯（Burdick&Jackson公司）；无水乙醇（分析纯，天津市化学试剂有限公司）；样品购自本地超市。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

分别精确称取恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星0.005g于50mL容量瓶中，然后用甲醇溶解并稀释至刻度，于冰箱4℃以下避光保存。用流动相液将恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星储备液液稀释成10μg/mL的工作液。

1.2.2 样品处理

称取试样0.5g（精确至0.1mg）于50mL具塞离心管中，准确加入6mL磷酸盐缓冲溶液，涡旋混匀，再加入10mL乙腈，于涡旋振荡器振荡提取1min，5000r/min离心5min，上清液过滤到鸡心瓶中，在残渣中加入5mL磷酸盐缓冲溶液，10mL乙腈，重复以上步骤，合并上清液，于50℃旋转蒸发，至乙腈全部蒸出。加入5mL磷酸盐缓冲溶液，混匀。

固相萃取小柱先用5mL甲醇、5mL水和5mL磷酸盐缓冲溶液活化，保持柱体湿润。将样液以1mL/min的流速全部过HLB固相萃取小柱，待液体完全流出后，先后以4mL水，4mL甲醇水溶液淋洗，抽干，用4mL氨水甲醇溶液洗脱于10mL具刻度离心管中，洗脱液于50℃，氮吹至约0.2mL时停止浓缩，用甲醇-甲酸溶液定容至1mL，5000r/min离心5min，过0.2μm滤膜，供液相色谱串联质谱分析。

1.2.4 仪器参数和测定条件

液相色谱条件：C8反相色谱柱（C82.1mm×50mm id，5μm）；柱温：30℃；流速：0.5mL/min；进样量：5μL；流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（15+85）。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；喷雾压力：35psi；干燥气流速：8mL/min；离子化温度：340℃。

2 结果与分析

2.1 样品提取方法的选择

喹诺酮类药物的化学结构中有羧基和哌嗪基，属于酸碱两性化合物，在酸性和碱性溶液中有较好的溶解性。因此尝试用磷酸盐缓冲液进行提取，此时待测物以负离子形式存在，过固相萃取小柱后就富集在了小柱上，然后再用酸化甲醇进行洗脱[1-4]。

2.2 色谱条件的优化

在一定的流动相条件下，喹诺酮类药物在小粒径的C18色谱柱上都有较好的保留，选择实验室常用的C8柱（50mm×2.1mm）。应用反相色谱条件时，LC-MS/MS分析方法应用的有机相主要为甲醇和乙腈，喹诺酮类药物在甲醇中的信号要比在乙腈中高，选用乙腈作为有机相时，待分析组分的色谱行为较好。实验发现甲酸的加入会抑制其信号，甲酸体积分数越高抑制信号越严重，但考虑到能够改善峰形，使待测物与内源性物质充分分离，所以选择了0.1%的甲酸作为水相（见图1）。

2.3 质谱条件的优化

对质谱条件进行优化，尽可能的使待测物响应信号达到最高。在优化过程中比较恩诺沙星在正、负两种离子化方式的响应值，发现正离子化效率远远高于负离子，正离子响应值高，因此选择了正离子扫描方式。采用Product扫描的方式选择特征离子，逐步加大诱导碰撞能量，随着母离子的丰度逐渐减少，子离子的丰度逐渐增加，分别选用丰度最大的两个子离子作为定量和辅助定性离子，并确定其最佳碰撞能量值，在Product方式中进一步调整碰撞能量，以便获得最大灵敏度（见表1，图2-4）。

2.4 线性与检出限

取阴性样品，依次加入适量待测物质标准系列溶液，在液相色谱-串联质谱设定条件下分别进样，以标准与内标物峰面积比值为纵坐标，工作溶液浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星检出限为10μg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

根据GB/T 5009.1-2003，我们选取1种空白饲料样品，分别加入50μg/kg水平的三种喹诺酮药物，按照样品处理方法及相同的色谱条件下，进行回收率的测定，每个样品重复3次，计算出每个添加水平的回收率（结果见表2）。

3 结论

本文建立了饲料中恩诺沙星、环丙沙星和诺氟沙星的高效液相色谱—串联四极杆质谱联用测定方法，该法具有样品处理简单、测定周期短等优点，适用于大量样品的快速筛选、测定。

参考文献

[1] 谢东华，俞雪钧，殷居易，倪梅林.高效液相色谱-质谱联用法检测烤鳗中环丙沙星[J].理化检验-化学分册，2008（44）5：402-408.

[2] 张翠英，徐金玲，王雪芹，安华民.超高效液相色谱- 串联质谱法检测盐酸洛哌丁胺胶囊中混入诺氟沙星的研究[J].中国药房，2008（19）7：537-539.

[3] 崔相勇，张凤清，周长民，王岩松，钟启智.高效液相色谱-质谱联用法测定豆芽中恩诺沙星含量[J].食品科学，2012（33）20：180-183.

[4] 李小玲，黄向荣，万译文，陈湘艺.高效液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星[J].中国渔业质量与标准，2013（3）4：25-30.