干扰素调节因子6 和视黄酸受体与非综合性唇腭裂的关系

张吉梅，罗 鹏*，冯红超

(1.贵州医科大学 公共卫生学院，贵州 贵阳 550004;2.贵阳市口腔医院，贵州 贵阳 550002)

非综合性唇腭裂(NSCL/P)是由于胚胎发育至6 ～12 周时，某些外界环境和遗传因素影响面突、腭突的外胚间质细胞，使腭突、面突的生长减慢甚至停止，导致面突、腭突联合和融合障碍，进而形成面部腭部裂隙，是口腔颌面部最常见的发育畸形之一，也是最严重的出生缺陷之一。近年来各国报道的唇腭裂发病率有上升的趋势，我国的发病率达1.82‰，个别省份可高达3.07‰［1］。在2006 年的一项时间跨度为80 年(1992－2002 年)的回顾性分析中报道，中国地区唇腭裂的发病率为1.46‰，亚洲地区的总发病率为1.56‰［2］。周翠萍［3］对贵阳市15 962 例围产儿出生缺陷结果分析发现，唇腭裂的构成比为7.83%。由此可以看出，唇腭裂的发病率在不同的年代，不同的地区均有不同。先天性唇腭裂常分为综合征性唇腭裂和非综合性唇腭裂，目前，已经了解到综合征性唇腭裂的病因是由于染色体异常和单基因突变导致的，但是非综合征性唇腭裂的病因和致病机制仍然没有得出结论。本研究通过免疫组织化学法，检测IRF6、RARA 在唇腭裂裂缘组织和正常组织中的表达，探讨与NSCL/P 发生的关系，报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本采集

选择2013 年6 月～2014 年12 月贵州地区非综合性唇腭裂患者唇腭裂裂缘的皮肤组织35 例作为病例组，年龄2 个月～12 岁，无其他畸形，排除综合性唇腭裂(NSO)，所有标本均是唇腭裂修复术患者的层，肌层和黏膜层大小约1.5 mm×2 mm。15 例贵州地区因口唇外伤，口唇部囊肿等行手术治疗的正常儿童唇部皮肤组织作为对照组，无先天性疾病史及唇腭裂史，年龄7 个月～15 岁，取1.5 mm×2 mm 大小唇部皮肤。

1.2 IRF6 和RARA 蛋白的测定

采用免疫组织化学法检测IRF6 和RARA 蛋白的表达，方法如下。严格按照试剂盒说明说进行染色。用10%甲醛液固定标本，石蜡包埋，作连续5 μm 切片标本，行HE 和免疫组化染色。组织切片脱蜡和水化，60 ℃45 min，用二甲苯I、II 各洗泡30 min 进行脱蜡;梯度酒精浸泡，PBS 缓冲液冲洗3 次，3 min/次。将脱蜡水化后的切片放在耐高温染色架上，放入柠檬酸缓冲液中，加热至高压锅喷气后3 min 后取出，室温冷却20 min，双蒸水冲洗3次，3 min/次。每张切片滴加1 滴3%的双氧水，烤箱中37 ℃孵育20 min 封闭内源性过氧化氢酶。滴加一抗，4 ℃恒温冰箱中过夜，恢复至室温，37 ℃温箱孵育30 min。DAB 显色，苏木素复染，脱水透明，封片。采用半定量的记录方法，400 倍光学显微镜下随机观察10 个视野，每个视野计数100 个细胞，计算阳性细胞所占比例，无阳性细胞为阴性(－)，阳性细胞比例=(阳性细胞数/总细胞数×100%)，其中25%为弱阳性(+)，25%～50%为中度阳性(++)，＞50%为强阳性(+++)。

1.3 统计学处理

SPSS 17.0 软件录入数据和分析。用χ2检验做单因素分析，变量进行Logistic 回归分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理学观察

HE 染色是显示实验组和对照组细胞核内染色质，细胞质内核糖体显紫蓝色，病例组颜色稍深，基底细胞层和表皮细胞层呈现红色，较正常对照组的颜色稍深。未发现病理变化。见图1。

2.2 IRF6 的表达

IRF6 在病例组和正常对照组中均有表达，表达部位主要在皮肤的基底细胞层，但是也有少部分在真皮成纤维细胞内表达，阳性细胞胞浆为棕色。正常对照组IRF6 的阳性表达明显低于病例组，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表1、图2。

表1 病例组和对照组IRF6 表达Tab.1 IRF6 expression in case group and control group

2.3 RARA 的表达

RARA 在病例组的表达主要在表皮的基底层细胞、真皮附属器的上皮细胞、基底层细胞、表皮细胞、真皮深层的成纤维细胞胞浆和细胞表面，呈棕色，阳性细胞胞浆为棕色。对照组的皮肤黏膜呈现弱阳性表达，与病例组比较，差异有统计学意义(P ＜0.05)。见表2 和图3。

表2 病例组和对照组RARA 表达Tab.2 RARA expression in case group and control group

3 讨论

图1 两组唇部组织的病理图片(HE，×400)Fig.1 Pathological observation of lip tissue in two groups

图2 IRF6 在病例组和对照组中的表达(400×)Fig.2 IRF6 expression in case group and control group

图3 RARA 在病例组和正常对照组中的表达(400×)Fig.3 RARA expression in case group and control group

目前，对NSCL/P 的病因和致病机制仍然没有得出结论。在遗传学领域，NSCL/P 被认为是一种复杂的多基因遗传性疾病，其发病机制尚未明确，但普遍认为该病是由遗传因素和环境因素共同作用引起的，遗传因素起到主要作用。人类胚胎的唇腭部发育主要在胚胎第3 ～8 周完成，所以环境因素通过母体作用于胚胎产生唇腭裂的关键时期就在胚胎的第3 ～8 周［4］。唇腭裂的基因定位及相关研究是目前国内外学者研究的热点和难点，实验及临床研究发现，与NSCL/P 发生有关的基因有TGFα、TGFβ1、TGFβ3、MSX1、MSX2、BCL3、EDN1、RARA、MTHFR、IRF 6 和TGFA 等［5］，其中，IRF6在双侧腭突的接触期及融合期发挥重要的调节作用［6］。尹海燕等［7］发现，过量维甲酸改变了昆明小鼠的胚胎神经管中RARA 基因的正常时间表达模式，这种异常可能是维甲酸致小鼠胚胎畸形的发生机制。IRF6 在口腔颌面部、生殖器官、牙蕾等处有较高水平的表达，是口腔颌面部发育的关键因子。国内外的研究成果表明，IRF6 基因突变与NSCL/P 的发病有着密切的关系，任红旺等［8］选取中国宁夏人群NSCL/P 患者进行研究，探讨IRF6基因rs642961 位点与NSCL/P 的相关性，发现唇裂组、唇腭裂组rs642961 的AA 基因型频率高于对照组，且A 等位基因存在过传递;杨明等［5］以新疆维、汉两民族各50 例NSCL/P 患者为研究对象，探讨IRF6 基因rs2013162 位点单核苷酸多态性在两民族内和民族间基因型和等位基因型的频率差异，发现rs2013162 位点GG 基因型和等位基因G 和T频率在NSCL/P 组和对照组中分布有差异，两民族间比较，维吾尔族GG 和TT 基因型和等位基因G的频率均高于汉族，证明新疆维、汉族NSCL/P 与rs2013162 位点GG 基因型及等位基因G 存在相关性;此外，还有研究证明IRF6 基因的rs4844880、rs2235375、rs7545538、rs7545542、等位点与NSCL/P 的发生相关联［9－11］。本研究通过免疫组织化学法发现，IRF6 在NSCL/P 裂缘组织中和正常黏膜组织中均有表达，表达部位主要在皮肤的基底细胞层，有少部分在真皮成纤维细胞内表达，正常黏膜组织中的表达较在NSCL/P 组织中弱且少，表皮的真皮附属器的上皮细胞、基底层细胞、细胞表面、真皮深层的成纤维细胞胞浆都呈现弱表达。RARA 基因分布在全身各种组织中，结合蛋白RAR-α、RAR-β、RAR-γ 参与视黄酸的体内运输和代谢过程，因此视黄类的致畸性主要由RARA 介导［12］。复合的RARA 基因无义突变可导致机体多处畸变，像头部、肢体及眼部缺陷等。尹海燕等［7］以维甲酸致昆明小鼠腭裂动物模型为基础，采用免疫组化法检测RARA 蛋白在颚板组织中的表达，研究发现，在过量维甲酸致昆明小鼠腭裂发生过程中，RARA 的表达被下调。本实验研究发现RARA主要在表皮的基底层细胞、真皮附属器的上皮细胞、基底层细胞、表皮细胞、真皮深层的成纤维细胞胞浆和细胞表面呈现棕色的阳性表达，在正常组的皮肤黏膜内则呈现弱阳性表达，在NSCL/P 裂缘组织中和正常黏膜组织比较有差异。综上所述，IRF6和RARA 在唇腭裂裂缘组织中的表达增高，可能与NSCL/P 的发生有关。

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