细胞周期蛋白D1、p16蛋白在胆汁反流性胃炎中的表达及意义

徐晓玲 朱海杭 王翠梅 曹 丽 凡兰桂 沈 琴 印 健

胆汁反流性胃炎（BRG）是慢性胃炎中一种较常见的类型，是由十二指肠胃反流引起的胃黏膜化学性炎性反应，与萎缩、肠化生等胃黏膜癌前病变有关［1］。胆汁反流可致胃小凹上皮增生，Dixon等［1］通过病理研究发现，胆汁反流可能与胃窦黏膜肠上皮化生有关，但其对胃上皮细胞生长的影响尚不明确，其是否有癌变倾向，以及与胃癌的关系需要进一步研究探讨。细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）是细胞周期的正调节因子，也是一种原癌基因，Cyclin D1蛋白过表达可以促使细胞增殖。抑癌基因p16是细胞周期的负向调控因子，对于细胞周期的调控作用突出，已成为肿瘤诊断的参考指标之一。有研究表明，Cyclin D1蛋白过表达、p16基因缺失与胃癌的发生密切相关，且是胃癌发生的早期事件［2－5］。本研究通过检测正常胃黏膜、BRG、癌旁组织、胃癌中的Cyclin D1、p16表达水平，探讨BRG与胃癌的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

随机选取2012年6月至2012年12月在本院病理科存档的胃癌标本50例，同时取癌旁组织50例（距离肿瘤组织边缘3～5 c m）。另随机选取2012年6月至2012年12月在本院消化内镜中心诊断的BRG组织标本50例（BRG纳入标准为胃镜检查发现黏液湖胆染，伴胃窦黏膜糜烂，伴或不伴有充血者），正常胃黏膜（即健康体检者，内镜下观察黏膜光滑，无水肿、出血、糜烂等表现）组织标本50例，对患者的年龄、性别等方面进行比较，显示差异均无统计学意义。

1.2 方法

标本常规行4μm连续切片，每例均行苏木精－伊红（HE）染色和免疫组织化学染色，光镜观察。免疫组织化学对照：以Cyclin D1、p16阳性的胃癌组织切片作为阳性对照，以磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）代替一抗作为阴性对照。主要试剂：Cyclin D1兔抗人单克隆抗体、p16兔抗人单克隆抗体、兔超敏二步法免疫组织化学检测试剂盒及DAB试剂盒均购自北京中杉金桥生物公司。

1.3 观察指标

p16蛋白的阳性判断参照Geradts等［6］的诊断标准。

Cyclin D1蛋白染色阳性为在细胞核内出现棕黄色颗粒，且其着色强度高于背景非特异性染色者。每例切片随机选取5个高倍视野进行结果判定。按染色强度及阳性细胞数占肿瘤细胞总数的百分比综合计分。染色强度：无色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。阳性细胞数：小于总数的5%计0分，5%～25%计1分，25%～50%计2分，大于50%计3分。染色强度得分与阳性细胞数得分相乘，0分计为阴性（－），1～3分计为弱阳性（＋），4～5分计为中度阳性（＋＋），≥6分计为强阳性（＋＋＋）［5］。

1.4 统计学处理

采用SPSS19.0统计软件，应用χ2检验进行统计学分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Cyclin D1、p16染色特征

采用En Vision法，见图1。

2.2 Cyclin D1、p16在不同类型组织的表达

Cyclin D1在正常胃黏膜、BRG、癌旁组织、胃癌中的阳性表达率逐渐升高，在BRG中的阳性表达率显著高于正常胃黏膜组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。p16在正常胃黏膜、BRG、癌旁组织、胃癌中的阳性表达率逐渐降低，在BRG中的阳性表达率显著低于正常胃黏膜组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。但Cyclin D1、p16在BRG、癌旁组织中的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 Cyclin D1、p16在不同类型组织中的表达情况

2.3 肠上皮化生和不典型增生检出率

BRG中的肠上皮化生检出率高于正常胃黏膜组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。BRG中的不典型增生检出率也高于正常胃黏膜组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 肠上皮化生和不典型增生在BRG和正常胃黏膜组织中的检出率

3 讨论

BRG是由于幽门功能不全，胃窦十二指肠协调运动障碍，胃排空延迟或胆囊功能障碍等因素导致过量含胆汁的十二指肠液反流入胃，破坏胃黏膜表面的黏液屏障，损伤黏膜上皮，引起黏膜充血水肿等炎性改变，临床表现缺乏特异性，主要依靠胃镜诊断，在病理学上存在一定比例的肠上皮化生和不典型增生。研究表明，长期胆汁反流可致胃小凹上皮增生和反流性食管炎鳞状上皮增生，并可能与肠化生甚至癌变有关。Barrett食管中胆汁反流可能是重要的致癌因素［7－9］。

有报道BRG与胃黏膜肠上皮化生相关，存在胃黏膜肠上皮化生的患者其胃内总胆酸的浓度明显高于无肠上皮化生者［10－11］。王学伟等［12］对大鼠胆汁反流模型研究发现，长期胆汁反流可导致大鼠胃黏膜腺上皮和鳞状上皮显著增生，并发生异型增生和癌变。本研究中BRG肠上皮化生和不典型增生检出率显著高于正常胃黏膜组，提示BRG可能与胃癌的发生相关。

Cyclin D是一组控制真核细胞周期进展的重要蛋白分子，Cyclin D1是其重要的亚型。Cyclin D1可结合细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）形成复合物Cyclin D1－CDK4，使Rb蛋白磷酸化，解除Rb基因调控G期停滞的作用，使细胞周期从G1期进入S期。Motokura等［13］研究指出，在生理状态下，细胞进入S期后Cyclin D1迅速分解。当Cyclin D1过度表达时，能缩短G1期，促使细胞提前进入S期。Cyclin D1基因的过度表达发生在胃黏膜上皮癌变的早期阶段，是重要的胃癌促发因素，其表达与胃癌的病理学类型、是否淋巴结转移等没有相关性。该基因可能作为一个潜在的胃癌早期诊断分子标志物，是癌变早期的分子事件之一［4，14］。

p16为细胞周期负调控蛋白，是一种多瘤抑制基因。Kamb等［15－16］报道，p16可通过与细胞周期蛋白竞争性结合周期蛋白依赖性激酶，从而抑制Cyclin D1－CDK4或CDK6的活性，降低抑癌基因Rb的磷酸化，阻止细胞由G1期进入S期，进而抑制细胞增殖。在细胞周期调控中，p16的失活和其缺失或突变在肿瘤发生过程中起着重要作用。p16基因表达可抑制胃癌细胞增殖并诱导胃癌细胞G1期阻滞［17］。有研究表明，胃癌及其癌前病变中均存在p16基因甲基化，表明p16蛋白产物缺失或丧失活性发生在胃黏膜上皮癌变的早期阶段，是重要的胃癌促发因素。p16基因也可作为一个潜在的胃癌早期诊断的分子标志物［18－19］。

本研究显示，随着胃黏膜病变的进展，p16蛋白的阳性表达率下降，而Cyclin D1的阳性表达率升高。在正常胃黏膜组织和BRG组织中p16的表达率高于Cyclin D1的表达，而在胃癌组织中p16的表达率低于Cyclin D1。两者在癌旁组织和BRG组织中的表达差异无统计学意义。表明Cyclin D1基因扩增和／或过度表达可引起肿瘤细胞异常增殖，p16基因缺失或突变而不能正常表达时也能引起肿瘤细胞异常增殖。提示BRG可能导致肿瘤的发生。

胃癌的发生发展是一个多因素、多步骤、多阶段逐步演进的过程，其中细胞周期的调控直接或间接影响着其进程［20］。Kishi moto等［21］发现胃癌在发生发展过程中至少需要2个活化癌基因的异常表达，近40%～50%的病例中出现p16／Rb缺失和Cyclin D1／CDK4过表达。

本研究表明，当p16蛋白减少时，Cyclin D1蛋白表达量却升高，使其能与CDK4更大程度地结合，促进细胞分裂增殖，进而导致胃癌的发生进展。p16蛋白与Cyclin D1蛋白表达可能呈反馈调节关系，参与胃癌的发生。因此，联合检测胃黏膜组织中Cyclin D1、p16的表达，对胃癌早诊断、早治疗及预后评估有一定的参考价值。本研究中Cyclin D1和p16在BRG中都存在异常表达，提示BRG可能有癌变倾向。

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