基于心肌细胞缺氧/复氧损伤的麦冬多糖提取工艺研究

王 帅，包永睿，杨欣欣，王思思，孟宪生*

(1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁 大连 116600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 116600)



基于心肌细胞缺氧/复氧损伤的麦冬多糖提取工艺研究

王 帅1,2,3，包永睿1,2,3，杨欣欣1,2,3，王思思1，孟宪生1,2,3*

(1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁 大连 116600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 116600)

目的：优化麦冬多糖提取工艺，并验证其对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法：采用L9(34)正交试验，以麦冬多糖含量为考察指标，以溶媒量、提取时间、提取次数为考察因素，筛选麦冬多糖最佳提取工艺；单因素实验，考察其最佳醇沉浓度；在此基础上，采用体外细胞实验建立乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型，以细胞损伤抑制率为指标，验证麦冬多糖对心肌细胞的保护作用。结果：麦冬多糖的最佳提取工艺为14倍量的水回流提取3次，每次1 h，醇沉浓度以80%为宜；按此工艺提取的麦冬多糖对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤具有较好的保护作用，但表现出一定的剂量、时间与药效的非线性关系。结论：本实验优化了麦冬多糖的提取工艺，同时验证了麦冬多糖对缺氧/复氧损伤型冠心病的治疗作用，为揭示其药效物质基础与大规模工业化生产提供参考。

麦冬；多糖；提取工艺；缺氧/复氧损伤

麦冬原名麦门冬，始载于《神农本草经》，列为上品，为百合科植物麦冬Ophiopogonjaponicus(L.f) Ker-Gawl.的干燥块根。甘、微苦，微寒，归心、肺、胃经，具有养阴生津、润肺清心的功效，用于治疗肺燥干咳、阴虚痨嗽、喉痹咽痛、津伤口渴、内热消渴、心烦失眠、肠燥便秘等症[1]。主要含有多糖、甾体皂苷、高异黄酮等化学成分，具有抗心肌缺血、降血糖、免疫调节等药理作用[2-3]。据文献报道，麦冬多糖是麦冬治疗心肌缺血的主要有效成分之一，本实验拟采用正交设计试验考察麦冬多糖的最佳提取工艺，同时建立乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型，验证此工艺条件下提取的麦冬多糖对缺氧/复氧损伤型冠心病的治疗作用，为该药在治疗冠心病方面的大规模工业化生产提供理论支持。

1 材料

1.1 仪器与设备

U-3010型紫外可见分光光度计(日本日立公司)；ACCULAB ALC-11C.4型电子天平(德国赛多利斯集团)；CO2培养箱(德国NΜAIRE公司)；SΜNRISE酶标仪(瑞士TECAN公司)。

1.2 药材与试剂

麦冬药材(购自安国药材批发市场，经辽宁中医药大学药学院翟延君教授鉴定为百合科植物麦冬Ophiopogonjaponicus(L.f) Ker-Gawl.的干燥块根)；葡萄糖对照品(批号110833-200904，购自中国药品生物制品检定所)；养心氏片(批号120205，青岛国风药业股份有限公司)；维拉帕米(批号20140201，天津市中央药业有限公司)；乙醇、浓硫酸、苯酚(分析纯，购自天津市科密欧化学试剂有限公司)；DMEM/F12培养基与胎牛血清(NBCS)(均购自美国GIBCO公司)。

1.3 细胞株与动物

SD大鼠原代乳鼠心肌细胞，由本实验室培养；清洁级昆明小鼠，体重18～22g，雌雄各半，购于大连医科大学实验动物中心，合格证号：SCXX(辽)2008-0002。

2 方法与结果

2.1 麦冬多糖检测方法

2.1.1 对照品溶液制备 精密称定105℃干燥至恒重的葡萄糖106.02mg，置于100mL容量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，再从中吸取10mL置于100mL容量瓶中，加蒸馏水使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 标准曲线绘制 精密吸取葡萄糖对照品0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于15 mL具塞试管中，加水至1.0mL。采用苯酚-硫酸显色法[4-5]，向各管中分别加入现配置的5%苯酚溶液1.0mL后，再迅速贴壁加入浓硫酸5mL，摇匀，室温静置30min。空白调零，在波长488nm处比色，测定吸光度值。以葡萄糖对照品浓度(C)为横坐标，吸光度值(A)为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程及相关系数为：Y=8.2835X+0.0402，r=0.9994，葡萄糖在21.204μg/mL～84.816μg/mL之间与吸光度A488有良好的线性关系。

2.2 麦冬多糖提取条件考察

经参考相关文献，确定影响提取效果的主要因素有溶媒量(A)、提取时间(B)、提取次数(C)三个因素，对主要影响因素各取3个水平，进行L9(34)正交试验，以麦冬多糖含量为考察指标，优选最佳提取条件[6-7]。将麦冬药材粉碎过10目筛，准确称取麦冬粉末500g，加入8倍量95%乙醇回流脱脂2次，1.5h/次。将药渣挥干直至无醇味，称重，将其平均分成10份，随机选取9份按正交表进行试验。见表1、表2。

表1 正交试验考察结果

表2 方差分析表

注：F0.05(2，2)=19.0。

通过直观分析和方差分析实验结果，发现影响因素的顺序为A>B>C，其中对提取率影响最大的为溶媒量(A)，具有显著性意义(P<0.05)。提取次数(B)和提取时间(C)的影响差异不大。因此优选的麦冬多糖提取条件为A3B1C3，即14倍量的水回流提取3次，每次1 h。由于提取溶媒量具有显著性差异，且最大量为最佳选择，故进一步考察了14、18、22倍量溶剂提取多糖的含量，结果差别不大，故确定最佳条件为14倍量的水回流提取3次，每次1h。

2.3 麦冬多糖醇沉浓度考察

取麦冬样品4份，每份50g，分别用8倍量95%乙醇回流脱脂2次，1.5h/次，药渣挥干至无醇味，分别加入14倍量的水，在100℃水浴中提取3次，1h/次，抽滤，浓缩。浓缩液分别加入乙醇调至终浓度为70%、75%、80%、85%乙醇，低温静置醇沉24h，测定含量，可知乙醇体积分数达到80%时麦冬多糖的含量最高，结果见图1。

2.4 麦冬多糖对SD乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

2.4.1 麦冬多糖含药血浆的制备 将60只清洁级昆明小鼠随机分为6组，每组10只。分别为空白组(给予等体积水溶液)、西药阳性对照组(0.00280g/kg/d)、中药阳性对照组(0.01404g/kg/d)、麦冬多糖高剂量组(0.04680g/kg/d)、麦冬多糖中剂量组(0.01560g/kg/d)、麦冬多糖低剂量组(0.00520g/kg/d)。每日灌胃给药2次，0.5mL/次，连续灌胃3天。取血前12h小鼠禁食不禁水，于最后一次灌胃1h后，摘眼球取血，置含有30μL肝素的2mL离心管中，静置30min，于高速离心机中，3 000r/min，离心15min，分离血浆，合并同组血浆。经56℃、30 min灭活处理后，过0.22μm微孔滤膜除菌，置-20℃保存备用。

图1 醇沉浓度考察结果

2.4.2 15%含药血浆对SD乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用 采用400μm的Na2S2O4作用于心肌细胞1h，建立心肌细胞缺氧/复氧损伤模型[8-10]。取中药阳性对照、西药阳性对照、麦冬多糖高中低剂量组的含药血浆，以15%的浓度作用于乳鼠心肌细胞，MTT法考察作用12、24、48h后，心肌细胞的损伤抑制率与时间剂量关系，见表3、图2。

表3 15%含药血浆对SD乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的损伤抑制率与时间剂量关系

注：与对照组比较*P<0.05。

结果可知，麦冬多糖高、中、低剂量组与对照组比较均有显著性差异，其中高剂量作用24h效果最好，损伤抑制率达68.73%，但随着作用时间的延长，效果减弱；低剂量给药12、24、48h作用效果稳定，且均接近50%；而中剂量损伤抑制率效果较差，均低于10%。

图2 15%含药血浆对SD乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用

3 讨论

本实验首先采用正交实验设计方法，优选了麦冬多糖最佳提取工艺，得到麦冬多糖提取物，进而采用血浆药理学方法证实了麦冬多糖灌胃后的小鼠血浆，对SD乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤有明显的损伤抑制作用，为其药效物质基础的阐释与工业化生产奠定良好基础。

麦冬多糖对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用实验，从给药剂量角度，麦冬多糖低、高剂量组作用效果更为显著，优于中药阳性对照药，而中剂量组损伤抑制作用不够明显，呈现出剂量上的非线性关系。从作用时间角度，低剂量作用12、24、48h，损伤抑制率均接近50%，作用效果较为稳定；中剂量损伤抑制率均较低，也基本稳定；但高剂量作用24h损伤抑制率达到最高点68.73%，明显高于12、48h，说明麦冬多糖对心肌细胞的保护作用受给药剂量、给药时间的影响较大，这可能与药物在体内的代谢有关，有必要从代谢规律角度进行更为深入的研究。

[1] 国家药典委员会．中国药典[S].一部．北京：中国医药科技出版社，2010：144．

[2] 黄光辉，孙连娜．麦冬多糖的研究进展[J]．现代药物与临床，2012，27(5)：523-529．

[3] 王庆慧，李铣，王金辉，等. 麦冬化学成分研究[J]. 中国现代中药，2009，11(11)：21-22.

[4] 冯怡，韩宁，徐德生，等．麦冬多糖含量测定方法的研究[J]．中成药，2006，28(5)：705-707．

[5] 王桂玲，房建强，赵雪梅，等．麦冬多糖水提醇沉工艺研究[J]．泰山医学院学报，2007，28(8)：603-605．

[6] 吕丽娟，马明辉，贡济宇，等．正交实验法优化麦冬多糖提取工艺[J]．长春中医药大学学报，2007，23(2)：30-31．

[7] 夏恒，曾佳，马建春，等. 麦冬多糖提取工艺优选研究[J]．亚太传统医药，2014，10(6)：30-32.

[8] CONG REN, YONG-RUI BAO, XIAN-SHENG MENG,etc.Comparison of the protective effects of ferulic acid and its drug-containing plasma on primary cultured neonatal rat cardiomyocytes with hypoxia / reoxygenation injury[J]. Pharmacognosy Magazine,2013, 9(35)：202-209.

[9] 蔡琳，孟宪生，包永睿，等. 基于体外心肌细胞活力的葛根提取工艺优选[J]. 中国实验方剂学杂志，2012，18(18)：17-19.

[10] 周朝伟，严冬. 心肌缺血再灌注损伤中医药研究进展[J]. 辽宁中医药大学学报，2014,16(3)：217-220.

(责任编辑：余 婷)

Study on the Extraction Process of Ophiopogon Polysaccharide Based on Myocardial Cell Hypoxia/Reoxygenation Injury

Wang Shuai1,2,3，Bao Yongrui1,2,3，Yang Xinxin1,2,3，Wang Sisi1，Meng Xiansheng1,2,3*

(1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600,China;2. Liaoning province multi-component Chinese Medicine Engineering Technology Research Center，Dalian 116600,China;3. Liaoning Province Modern Traditional Chinese Medicine Research and Engineering Laboratory，Dalian 116600,China;)

Objective:To determine the optimal extraction process of Ophiopogon polysaccharide, and verify the protective effect to myocardial cell hypoxia/reoxygenation injury.Methods:L9(34) orthogonal experiment was used, taking the content of Ophiopogon polysaccharide as index, solvent amount, extraction time, extraction times as examine factors, to screen the optimal extraction process. Single factor experiment was used to examine the best alcohol concentration. On this basis, cells in vitro experiment is adopted to establish the model of rat myocardial cell hypoxia/reoxygenation injury, and the cell damage inhibition rate was taking as index to verify the protective effect of Ophiopogon polysaccharide.Results:The optimal extraction process is 14 times the amount of water, extracting three times, each time 1 h, ethanol precipitation concentration is 80%, with this process, the extract of radix ophiopogonis polysaccharide presents good protective effect to cells of rats myocardial hypoxia/reoxygenation injury, but show a certain dosage, time and efficacy of the nonlinear relationship.Conclusion:This experiment optimized the extraction process of Ophiopogon polysaccharide, and verified the therapeutical effect of polysaccharide on hypoxia/reoxygenation injury model of coronary heart disease, which provide a reference for revealing its efficacy material base and mass industrial production.

Radix Ophiopogonis；Polysaccharides；Extraction Process；Hypoxia/reoxygenation Damage

2014-10-12

“十一五”“重大新药创制”科技重大专项(2010ZX09401-304-515)；沈阳市科技计划项目(F12-146-9-00)

王帅(1984-)，女，硕士，辽宁中医药大学药学院实验师，研究方向为中药质量分析及作用机制研究。

孟宪生(1964-)，男，博士，辽宁中医药大学教授，研究方向为药物组分配伍、代谢组学及药品质量分析。E-mail：mxsvvv@126.com

R284.2

A

1673-2197(2015)03-0016-03

10.11954/ytctyy.201503007