舒筋活血止痛水外擦拍打对兔膝骨性关节炎软骨组织MMP-1表达的影响

邱艺斌，何 坚，苏水珠，李 姗，罗庆禄*

(1.福建中医药大学，福建 福州 350122；2.福建中医药大学 康复医学院，福建 福州 350122)



舒筋活血止痛水外擦拍打对兔膝骨性关节炎软骨组织MMP-1表达的影响

邱艺斌1，何 坚2，苏水珠1，李 姗1，罗庆禄2*

(1.福建中医药大学，福建 福州 350122；2.福建中医药大学 康复医学院，福建 福州 350122)

目的：观察舒筋活血止痛水外擦拍打治疗对兔膝骨性关节炎(KOA)软骨组织MMP-1表达的影响。方法：随机将15只新西兰大白兔分为正常组、模型组、拍药组，采用前交叉韧带切断术(ACLT)，制作KOA模型。术后6周拍药组进行舒筋活血止痛水外擦拍打干预。干预2周后处死动物，采用HE染色观察软骨形态学改变，并进行改良Mankin评分，免疫组化检测MMP-1的表达情况。结果：模型组改良Mankin评分明显增高，拍药组改良Mankin评分低于模型组，差异有统计学意义(P<0.01)；模型组MMP-1阳性表达显著增强，拍药组MMP-1阳性表达较模型组降低，差异有统计学意义(P<0.01)。结论：舒筋活血止痛水外擦拍打治疗可明显降低兔KOA软骨组织MMP-1的表达，延缓兔KOA的进展。

膝骨性关节炎；软骨；舒筋活血止痛水；MMP-1

膝骨性关节炎(Knee Osteoarthritis，KOA)是以关节软骨退变为主的临床常见骨科疾病。KOA属中医学“骨痹”“膝痹”范畴，中医认为本病多为“本虚标实”之证。舒筋活血止痛水治疗KOA能起到标本兼治的作用，临床实践证实用其外擦结合中医拍打法治疗KOA疗效显著，但具体机制不明。研究表明，软骨基质的破坏与MMP-1的增高密切相关[1-2]。因此，本研究采用舒筋活血止痛水外擦拍打干预兔膝骨性关节炎模型，通过观察软骨组织形态学及MMP-1表达的变化，探讨舒筋活血止痛水治疗的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物

15只6月龄健康的新西兰大白兔，体重(2.5±0.5)kg，由福建中医药大学动物实验中心提供。15只兔随机分为正常组、模型组、拍药组，每组各5只。

1.2 实验主要药物、试剂及器材

舒筋活血止痛水由福建中医药大学附属康复医院提供；抗兔MMP-1多克隆抗体购于北京博奥森生物技术公司，免疫组化试剂盒购于迈新生物技术公司，EDTA-2Na购于天津福晨化学试剂厂，苏木素、伊红染液由福建中医药大学中西医结合研究院提供；组织切片机及电子显微镜为德国徕卡公司产品。

2 方法

2.1 KOA造模

前交叉韧带切除术(ACLT)是一种被广泛应用且有效的膝骨关节炎动物模型建立方法[3]。其原理是通过手术导致动物膝关节不稳定，在不限制术后动物活动的情况下，造成软骨退变磨损。除正常组外，模型组和拍药组兔子均行右膝ACLT术。

2.2 干预方法

术后6周，对拍药组动物进行相应的干预。固定好动物，剃除右膝关节周围毛发，均匀涂上舒筋活血止痛水外擦剂，在膝关节周围用食指、中指和环指第二指节掌面轻微拍打涂有舒筋活血止痛水处，以不使动物有惊恐感为度。每次10min，每天1次，连续6天为1疗程，停1天，再行下1个疗程，共干预2个疗程。

2.3 标本取材

空气栓塞法处死动物，分离右侧膝关节股骨髁，肉眼大体观察软骨组织形态，将标本浸泡于10%EDTA-2Na脱钙液中脱钙，至针灸针能轻松穿透标本后，矢状切取股骨内侧髁相同部位大小0.5cm×0.4cm×0.2cm石蜡包埋。

2.4 组织形态学观察

垂直软骨面切4μm切片，采用苏木精-伊红染色(HE染色)，光学显微镜观察，按改良Mankin评分标准进行评分。

2.5 软骨组织MMP-1测定

连续切片4μm，切片脱蜡入水。柠檬酸法抗原修复，置于微波炉加热，温度95～100℃； 3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，室温10min；滴加血清封闭液，室温封闭30min；滴加1∶200稀释的抗兔MMP-1抗体，4℃孵育过夜；滴加生物素标记的二抗，室温孵育10min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，室温孵育10min； DAB室温下显色至满意，清水终止显色反应；苏木素复染细胞1min，PBS返蓝20min；脱水透明后封片。

2.6 图像分析

每张组织切片均在相同部位拍摄，应用Leica Application Suite V4图像采集软件每张组织切片摄取4个视野，每组共20张图片；HE染色图片采用改良Mankin评分标准进行评分；MMP-1免疫组织化学图片采用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件测定相同面积MMP-1阳性表达的光密度值(indicator optic density，IOD)。

2.7 统计学处理

3 结果

3.1 软骨组织HE染色

正常组软骨表面光滑平整，各层细胞分布均匀，排列整齐，潮线完整，着色均匀；模型组软骨表面不平整，表层软骨出现纤维化变性及软骨缺损，有裂隙深达中、深层，各层软骨细胞排列紊乱，出现簇集现象，潮线中断或出现多重潮线，染色不均匀，出现失染现象；拍药组软骨表面不平整，各层软骨细胞排列稍不齐，可出现簇聚的软骨细胞，潮线某些标本有出现断裂，个别标本有失染现象(见图1)。与正常组相比(见表1)，模型组改良Mankin评分明显增高，组间差异有显著统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，拍药组评分明显降低，组间差异有显著统计学意义(P<0.01)。

图1 三组软骨组织HE染色结果(×200)

组别例数(n)Mankin评分正常组200.95±0.89模型组208.75±1.921)拍药组205.00±1.122)

注：与正常组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.01。

3.2 软骨MMP-1免疫组织化学染色

正常组软骨细胞偶见散在MMP-1阳性染色，且染色较浅；模型组有大量深棕色MMP-1强阳性染色；拍药组可见中等量的MMP-1阳性染色(见图2)。三组软骨组织MMP-1免疫组化检测所得的IOD值组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。与正常组比较(见表2)，模型组MMP-1阳性表达显著升高(P<0.01)；与模型组比较，拍药组MMP-1阳性表达明显下降，组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。

图2 三组软骨组织MMP-1免疫组化结果(×400)

组别例数(n)IOD值正常组201805.82±847.35模型组2012963.82±3977.761)拍药组206542.65±1809.542)

注：与正常组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.01。

4 讨论

KOA病因及发病机制至今尚未完全明确，正常情况下，软骨基质的降解与合成保持动态平衡，而在KOA关节软骨中则表现为降解大于合成，软骨基质破坏。金属蛋白酶(matrix metalloproteases，MMPs)是降解细胞外基质的主要酶系，在OA发病过程中起重要作用[4-5]。其中MMP-1在MMPs家族中属于胶原酶，能直接降解软骨基质中最主要的Ⅱ型胶原。研究表明，软骨基质的破坏与MMP-1的增高密切相关，MMP-1表达越高则软骨破坏越严重[1-2]。因此，MMP-1胶原酶与KOA的病理过程密切相关，MMP-1水平的变化可以反映干预措施治疗KOA的效果。

KOA属中医学“骨痹”“膝痹”范畴，中医认为，痹症发生是由风、寒、湿邪侵犯人体，邪气流着于关节，经脉受阻，加之年老肝肾不足、气血亏虚、筋骨失养，故本病多为“本虚标实”之证。如《素问·痹论》指出“风寒湿三气杂至，合而为痹也”，强调了外邪为本病致病因素。《类证治裁·痹证》云:“诸痹……由营卫先虚，腾理不密，风寒湿乘虚内袭。正气为邪所阻，不能宣行，因而留滞，气血凝涩，久而成痹”，阐述了本病为正气不足，外邪乘虚侵袭经络所致。根据中医病因病机，KOA的中医疗法主要为舒筋活血、补益肝肾、祛寒除湿、行气止痛。临床上，以补肾舒筋活血法治疗KOA最为多见，不少临床报道运用舒筋活血法治疗各种损伤疗效明显[6-7]。

福建中医药大学附属康复医院院内制剂舒筋活血止痛水(闽Q/YZ-2005-168)，临床证实用其外擦结合中医拍打法治疗KOA疗效显著。该方主要由川乌、草乌、红花、当归、怀牛膝、三棱、木瓜等组成，川乌、草乌、木瓜具有祛寒除湿功效；当归、红花、三棱、三七能补血活血止痛；怀牛膝、五加皮能补肝肾、强筋骨，全方标本兼治，共奏祛寒除湿、舒筋活血、补益肝肾的作用，符合KOA发病的中医病因病机。

本实验采用舒筋活血止痛水外擦拍打的干预方式，通过实验探讨舒筋活血止痛水治疗KOA可能的作用机制。本研究发现，舒筋活血止痛水外擦拍打治疗兔KOA，在形态学上可明显抑制软骨破坏(见图1、表1)。对于软骨组织MMP-1表达的影响，同样为拍药组阳性表达低于模型组(见图2、表2)，组间比较有非常显著的差异(P<0.01)。改良Mankin评分结果与MMP-1免疫组化结果一致，说明了舒筋活血止痛水外擦拍打治疗兔KOA能取得肯定疗效，其起作用途径可能是通过降低软骨组织MMP-1的表达，从而延缓兔KOA的进展。

[1] 吴宏斌，杜靖远，胡勇，等．兔前交叉韧带切断骨关节炎模型中MMP-1、MMP-13及TIMP-1的mRNA表达研究[J]．中华风湿病学杂志，2002，6(3)：169．

[2] 杨丰建，俞永林，乔健，等．兔骨关节炎模型的建立以及关节炎软骨组织中MMP-1/-13的表达[J]．复旦学报：医学版，2007，(4)：563-567．

[3] SAH RL，YANG AS，CHEN AC，et al．Physical properties of rabbit articular cartilage after transection of the anterior cruciate ligament [J]．Orthop Res，1997，15(2)：197-203．

[4] MURPHY G，KNAUPER V，ATKINSON S， et al．Matrix metalloproteinases in arthriticdisease [J]．A rthritis Res，2002，4(Suppl 3)：S39-49．

[5] MURPHY G，NAGASE H．Reappraising metalloproteinases in rheumatoid arthritis and osteoarthritis：destruction or repair？[J]．Nature Clinical Practice Rheumatology，2008，4(3)：128-135．

[6] 李念虎．补肾活血中药治疗早中期膝骨性关节炎临床观察[J]．中医正骨，2006，18(10)： 11-12．

[7] 张培宪，秦学敏．中药熏蒸膝骨性关节炎78例临床观察[J]．天津中医药，2006，23(3)：202-202．

(责任编辑：魏 晓)

Effects of Shujin huoxue zhitong shui on MMP-1 Expression in Cartilage of Rabbit Knee Osteoarthritis

Qiu Yibin1, He Jian2, Su Shuizhu1, Li Shan1, Luo Qinglu2*

(1.Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China;2.Rehabilitation Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China)

Objective:To explore the effect of shujin huoxue zhitong shui on rabbits knee osteoarthritis about the chondrocytes MMP-1 expression. Methods:Fifteen rabbits were randomly divided into three groups: normal group, model group and drug group. In addition to the normal group, the other two group rabbits received anterior cruciate ligament transaction, and the intervention carried out after six weeks. Remove the femoral condyle cartilage after two weeks' intervention. Hematoxylin-eosin staining was conducted for histological observation of rabbit articular cartilage, and the cartilage structure were assessed and quantified with the modified Mankin rating criteria; immunohistochemistry were used to assess the expressions of MMP-1 in rabbit chondrocytes. Results:The modified Mankin score is significantly higher of model group, the score of drug group is lower than model group, with a significant difference (P<0.01). There is a strong expression level of MMP-1 in the model group rabbit chondrocytes. The MMP-1 expression level is lower in drug group, with a significant difference (P<0.01). Conclusion:Shujin huoxue zhitong shui can delay the development of osteoarthritis by inhibiting the MMP-1 expressing of rabbit chondrocytes.

KOA；Cartilage；Shujin huoxue zhitong shui；MMP-1

2014-09-23

国家自然科学基金项目(81273774)

邱艺斌(1987-)，男，福建中医药大学硕士研究生，研究方向为骨与关节疾病的康复。

罗庆禄(1973-)，男，博士，福建中医药大学副教授，研究方向为骨与关节疾病的康复。E-mail：luo＿qinglu@126.com

R285.5

A

1673-2197(2015)03-0008-03

10.11954/ytctyy.201503004