HPLC法测定四川朱砂莲生品及不同炮制品中马兜铃酸A含量

任华忠(乐山职业技术学院 药学系，四川 乐山 614000)



HPLC法测定四川朱砂莲生品及不同炮制品中马兜铃酸A含量

任华忠
(乐山职业技术学院 药学系，四川 乐山 614000)

目的：研究不同炮制方法对四川朱砂莲中马兜铃酸A含量的影响。方法：采用4种不同的炮炙去毒方法对朱砂莲样品进行处理后，采用HPLC法对其马兜铃酸A的含量进行检测，并与生品中所含马兜铃酸A的含量进行分析比较。色谱条件：色谱柱为Agilent-C18柱(4.6mm×150mm,3.5μm)，流动相：0.1%碳酸铵溶液-乙腈(72∶28)，流速：1mL·min-1，检测波长250nm，柱温为28℃。结果：除蒸制组外，经蜜炙、甘草汁炙、碱水炙处理的四川朱砂莲样品与生品比较，马兜铃酸A的含量差异显著，有统计学意义(P<0.01),变化率超过80%。结论：蜜炙、甘草汁炙、碱水炙在四川朱砂莲的炮制处理中起到了很好的减毒作用。

朱砂莲；炮制；马兜铃酸；高效液相色谱

朱砂莲为马兜铃科马兜铃属植物四川朱砂莲AristolochiacinnabarinaC.Y.Cheng et J.L.Wu的干燥块根，是我国西南各省民间习用的一种止痛中药[1，2]。传统医学认为朱砂莲性味苦、辛、寒，具清热解毒、消炎止痛之功效，在民间广泛用于治疗牙痛、胃痛、关节痛，现代药理研究表明其具有镇痛、抗炎、解热等作用。但近年来时有关于朱砂莲肾毒性的报道[3]，朱砂莲使用安全性的质疑越来越大。其安全性问题的根源在于所含的马兜铃酸类物质[4]，同时也跟超剂量使用等不合理用药方法有关[5]，有研究指出可以通过合理配伍和炮制方法减轻和控制其毒性[6,7]。基于此，笔者采用传统中药炮制去毒方法处理朱砂莲，并以HPLC法测定生品及各个炮制品中马兜铃酸A的相对含量，为朱砂莲的炮制去毒及合理使用提供参考依据。

1 仪器与试药

Waters2695高效液相色谱仪，包括自动脱气机、自动进样器、二元泵、柱温箱、996型二极管阵列检测器、Millennium32色谱工作站(美国Waters公司)；UV-3010型紫外-可见分光光度计(日本日立公司)；PHS-2F型台式pH计(上海雷磁公司)；KS150D型超声波清洗器(深圳洁威公司)。

马兜铃酸A对照品购于中国食品药品检定研究院(批号110746-200406)。乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

朱砂莲药材购于四川省峨眉山市中药材集市，经香港浸会大学邬家林教授鉴定为马兜铃科马兜铃属植物四川朱砂莲(A.cinnabarinaC.Y.Cheng et J.L.Wu)的块根。

2 方法与结果

2.1 样品处理

生品：取净制后的朱砂莲晒至完全干燥，为1号样品。蒸制品：取净制后的朱砂莲蒸至透心，烘干，为2号样品。蜜炙品：取净制朱砂莲按照《中药药典》附录药材炮制通则[7]记载的方法进行蜜炙(100g净药材，用炼蜜25g)，为3号样品。碱水炙品：取净制朱砂莲按照文献[8]方法进行碱水炙(100g净药材，用碳酸钠2g)，为4号样品。甘草汁炙品：取净制朱砂莲，按照文献[8]方法进行甘草汁炙(100g净药材，用甘草6g)，为5号样品。1～5号样品各设3个平行组。

2.2 马兜铃酸A含量测定

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取马兜铃酸A对照品适量，加乙醇溶解，制成0.052mg·mL-1的对照品溶液，备用。

2.2.2 供试品溶液制备 取样约1g，精密称定，置于圆底烧瓶中，加入乙醇100mL，称定重量，回流提取2h，放冷，再次称定重量，分别用溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，离心，取上清液，即得。

2.2.3 色谱条件 色谱柱为Agilent-C18柱(4.6mm×150mm, 3.5μm)，流动相：0.1%碳酸铵溶液-乙腈(72∶28)，流速：1mL·min-1，检测波长为250nm，柱温为28℃。在此色谱条件下，各样品溶液中马兜铃酸A与其他组分能达到基线分离，见图1。

2.2.4 线性关系 精密吸取浓度为0.052mg·mL-1的对照品溶液1、2、3、4、5、6、7mL，用乙醇稀释并定容至10mL。在上述色谱条件下进样10μL进行测定，记录色谱图，测定其峰面积，以峰面积(y)为纵坐标，马兜铃酸A量(x)为横坐标，进行线性回归，得回归方程为y=141 099x+35 174,r=0.999 8(n=7)，线性范围为52～364ng/mL。

2.2.5 精密度试验 精密量取马兜铃酸A对照品溶液，加乙醇稀释至0.26mg·mL-1。精密吸取该对照品溶液10μL，连续进样6次，测定马兜铃酸A峰面积，结果RSD为1.32%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取该对照品溶液，在室温下自然放置，分别于0、1、4、8、12、24h进行测定。结果6次测得马兜铃酸A峰面积的RSD为1.35%，表明对照品溶液在24h内稳定。

2.2.6 重复性试验 取样品约1g，共6份，精密称定，照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液并测定。结果6次测得马兜铃酸A含量的RSD为1.43%。表明测定方法重复性良好。

2.2.7 加样回收率试验 取本品约1g，共6份，精密称定，分别置圆底烧瓶中，各精密加入一定量的马兜铃酸A对照品，照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液并测定，结果见表1。

图1 马兜铃酸A对照品(A)、供试品(B)HPLC图谱

表1 加样回收率试验结果

2.2.8 样品含量测定 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，用外标法计算含量，结果见表2。

表2 朱砂莲生品与不同炮制品马兜铃酸含量测定结果 (n=3)

3 讨论

四川朱砂莲的使用受到很大限制的根本原因是其所含马兜铃酸可造成肾损害，而据目前的文献资料，马兜铃科中药的肾毒性受剂量高低、疗程长短、个体差异、炮制方法等因素影响。本研究中，蒸制品与生品相比，马兜铃酸A含量差异较小，而三组炙品与生品之间比较，马兜铃酸A含量差显著异，有统计学意义(P<0.01)。另外，不同的炮制去毒方法对马兜铃酸含量影响十分明显。其中蜜炙、甘草汁炙、碱水炙三种炮制方式起到了较好的去毒作用。近年来不断有四川朱砂莲毒性反应报道，应该采取谨慎使用的态度，可通过炮制去毒和改变用药途径等方面的研究来探索其合理使用的可能性。

[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M]. 上海:上海科学技术出版社,1998.

[2] 邬家林.朱砂莲的考证[J].中药材，1985(5):46.

[3] 黄仁发.朱砂莲中毒致急性马兜铃酸肾病[J].药物不良反应杂志，2007, 9(6):412.

[4] 徐晓月,张陆勇,江振洲.马兜铃酸I肾毒性的实验研究[J].中国生化药物杂志，2006,27(6):336.

[5] 梅全喜,高玉桥,胡世林.应理性对待含马兜铃酸类中药[J].中国药房，2006,17(7):554.

[6] 刘雅婧.细辛中马兜铃酸的炮制脱毒研究[D].吉林:吉林农业大学,2008.

[7] 中国中医科学院中药研究所. 一种去除中药中马兜铃酸的方法及其限量标准：中国，CN 1O1264116A[P].2007-3-14.

[8] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:化学工业出版社,2010.

[9] 唐廷猷.中药炮制学[M].北京:中国医药科技出版社,1997:137.

[10] 路金才,韩娜,杜晓曦,等.马兜铃酸的测定方法现状分析[J].中草药，2006,37(7):1113.

[11] 胡芳,潘金火.关木通及其炮制品中马兜铃酸A的含量变化[J].时珍国医国药,2009,20(3):672.

(责任编辑：魏 晓)

Determination of the Content of Aristolochic Acid-Ain processed Aristolochia Cinnabarina by HPLC

Ren Huazhong
(Leshan Vocational & Technical college,Leshan 614000,China)

Objective:To research the content changes of Aristolochic Acid-A in processedAristolochiaCinnabarina. Methods:Columnhypersil Agilent-C18(4.6mm×150mm,3.5μm).Mobile phase:Solution of acetonitrile and ammonium carbonate(72∶28),detection wavelength: 250nm,flow rate:1.0mL/min,the column temperature was 28℃. Results:Except by steamed AristolochiaCinnabarina, there was significant difference between products that processed by honey, succus liquiritiae or sodium carbonate and raw materials of aristolochic acid A content by the rate of more than 80%(P<0.01). Conclusion:Processed by honey, succus liquiritiae or sodium carbonate played a good role in disintoxication of Aristolochia Cinnabarina.

AristolochiaCinnabarina；Processing Technique；Aristolochic Acid-A;HPLC

2015-01-12

乐山职业技术学院科研课题(KY2013034)；乐山市科技局重点研究计划(14SZB248)

任华忠(1981-)，男，乐山职业技术学院讲师，研究方向为天然活性产物和中药质量标准。

R284

A

1673-2197(2015)11-0023-02

10.11954/ytctyy.201511010