白簕总黄酮、多糖的体外抑菌作用研究

王 艳，石瑛翘，潘育方(广东药学院，广东 中山 528458)



白簕总黄酮、多糖的体外抑菌作用研究

王 艳，石瑛翘，潘育方*
(广东药学院，广东 中山 528458)

目的：研究白簕总黄酮提取液醇洗脱、水洗脱部分和多糖提取部分对常见菌种的抑菌活性。方法：通过白簕的总黄酮提取液醇洗脱部分与水洗脱部分、多糖提取物对枯草杆菌、痢疾杆菌等5种常见临床细菌进行纸片扩散法实验、试管稀释法实验，研究药物不同成分的抑菌作用。结果：白簕总黄酮提取液醇洗脱部分对枯草杆菌、伤寒杆菌的最低抑菌浓度为0.131 3mg/mL，对痢疾杆菌、大肠杆菌、金葡萄球菌的最低抑菌浓度为0.262 5mg/mL;白簕总黄酮水洗脱部分对伤寒杆菌、金葡萄球菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、枯草杆菌的最低抑菌浓度均为0.296 0mg/mL。白簕多糖的体外抗菌实验结果出现杂菌，未能探究出结果。结论：白簕总黄酮提取液醇洗脱部分抑菌作用强于水洗脱部分，多糖无明显抗菌作用。

白簕;总黄酮；多糖；体外抑菌；最低抑菌浓度

白簕(AcanthopanaxTrifoliatus)又称鹅掌簕、三叶五加、三加皮、苦刺，为五加科攀援状灌木。白簕味苦，性辛、凉，气微香，具有疏风、消肿、止痒等功效，此外还具有多种食疗功效[1]。白霸嫩叶枝梢中含有丰富的氨基酸和人体必需的矿物质元素，氨基酸总含量达20.8%，其中谷氨酸含量最高，具有健脑和增强脑细胞呼吸作用的功能。白簕中含有黄酮、皂苷、香豆素、多糖、强心苷等药用成分，薄层色谱结果显示白簕总黄酮中含芦丁、金丝桃苷等黄酮醇单体。白簕作为蔬菜和药材有着悠久历史，其体外抑菌作用集中在对白簕黄酮的研究[2-4]。近年来，越来越多的多糖被发现有抑菌活性。本试验采用琼脂扩散法定性研究中药白簕总黄酮两种洗脱物和粗多糖对临床常用菌种抑菌活性的强弱；采用连续稀释法定量它们的抑菌浓度(MIC)、最低杀菌浓度(MBC)；评价白簕的药用价值，为深入开发利用白簕提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与药品

UV-1800紫外可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；HPD-600(极性)大孔树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)；AB-8(弱极性)大孔树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)；LDZX-50FAS 型立式压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；ZHJH-C1209C 型超净工作台(上海智诚分析仪器制造有限公司)；白簕叶、白簕茎(广东省恩平市大人山簕菜茶)均经广东药学院中药学院中药资源系刘基柱副教授鉴定为五加属，标本保存于广东药学院中药学院标本室；木瓜蛋白酶(上海蓝季科技发展有限公司)；注射用青霉素钠(河南新乡华星药厂，国药准字H41020817)；注射用硫酸链霉素(深圳华药南方制药有限公司，国药准字H20054140)；其余均为国产分析纯。

1.2 细菌

伤寒杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌均由广东药学院化工学院实验中心提供，经分离培养，无污染。

1.3 白簕总黄酮的制备

经响应面优化和验证实验后，确定采用回流提取法从白簕叶中提取黄酮。称取白簕叶粉末2g，提取白簕叶总黄酮的方法为固液比1∶45，提取液为浓度50%的乙醇，温度为50℃，采用回流法提取，共提取2次，每次提取3h。提取液经过HPD-600 大孔树脂洗脱提纯，装柱的大孔树脂为600mL，上样量为300mg；上样后待大孔树脂吸附12h 左右；采用1滴/8s的流速，先用水进行洗脱，待洗脱下的溶液为接近无色时，分别用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇，直至洗脱下的溶液呈无色。分别收集、挥去部分溶剂后，记录体积。紫外可见分光光度计测得白簕总黄酮纯化液水洗脱部分浓度为1.184mg/mL，醇洗脱部分浓度为0.525mg/mL。总黄酮提取物于4℃冰箱中保存。

1.4 白簕多糖的制备

采用热水浸提法，称取白簕茎粉末500g，加入40倍水，80℃恒温水浴锅中浸提6h，提取多糖后，去除药渣，最后旋转蒸发器55℃下浓缩至原来溶液体积的1/10。酶法除蛋白，加入2%木瓜蛋白酶，50℃水浴4h，加热到100℃，10s灭酶，得酶解液，置于3 500r/min离心10min去蛋白。取上层清液，按照4∶1的比例加入95%乙醇进行醇沉，置于冰箱4℃中过夜。第2天 3 500r/min离心10min，弃上清液，合并沉淀，于60℃烘箱中烘干，即得到白簕粗多糖。粗多糖于干燥器中常温保存。

1.5 抑菌实验

采用纸片扩散琼脂法:吸取有不同药液的圆滤纸片(直径6mm，每片吸取黄酮药液500μL，青霉素33.3μL，链霉素25μL；根据菌种类型选择阳性对照药液)贴于MH琼脂平板表面，37℃恒温箱培养16～18h。重复4次，培养完成后用游标卡尺测量抑菌圈直径(精确到0.1mm)，记录实验结果。

试管稀释法：取10支无菌小试管排于试管架上，编号，如表1加入后，置于37℃恒温箱内培养16h。凡澄清透明的的管判定为无菌生长，以无菌生长的最高药物稀释度为该药液对细菌的MIC。从上述无菌生长的试管中挑取培养液，划线接种于MH肉汤琼脂平板上，37℃恒温箱培养24h。平板上无菌落说明对应管中细菌全被杀死，重复3次，以无菌生长的最高药物稀释浓度为该药对细菌的MBC。试管稀释法见表1。

表1 试管稀释法

1.6 统计学方法

2 实验结果

2.1 白簕叶不同成分纸片琼脂扩散法抑菌结果

白簕叶总黄酮醇洗脱部分对枯草杆菌的抑菌效果比水洗脱部分强，但2种提取物都比阳性对照药液的抑菌作用弱。白簕多糖纸片无抑菌作用。 纸片扩散法结果见表2。

表2 白簕叶不同成分纸片琼脂扩散法抑菌结果

注：与抗生素比较，*P<0.01。

2.2 白簕总黄酮醇洗脱部分试管稀释法抑菌结果

白簕叶总黄酮醇洗脱部分与白簕叶总黄酮水洗脱部分对各种供试菌液都有不同程度的抑菌作用，并且这种抑菌作用随着黄酮提取液浓度的升高而增强。详见表3、表4。

2.3 白簕总黄酮水和醇洗脱部分MBC

白簕叶总黄酮水洗脱部分对金葡萄球菌、伤寒杆菌、枯草杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌的最低杀菌浓度均为0.592mg/mL;白簕总黄酮醇洗脱部分对伤寒杆菌、痢疾杆菌、大肠杆菌的最低杀菌浓度均为0.262 5mg/mL，对枯草杆菌的最低杀菌浓度为0.131 3mg/mL。总黄铜醇洗脱部分对金葡萄菌未体现出最低杀菌浓度，结果见表5。

表3 白簕总黄酮醇洗脱部分试管稀释法抑菌结果

注:“+”表示细菌生长，“-”表示细菌未生长。

表4 白簕总黄酮水洗脱部分试管稀释法抑菌结果

注:“+”表示细菌生长，“-”表示细菌未生长。

表5 白簕总黄酮水和醇洗脱部分MBC (mg/mL)

注：-表示MIC最高稀释浓度有细菌生长。

3 讨论

本实验应用体外抗菌试验测定白簕总黄酮醇洗脱部分和水洗脱部分、多糖的抑菌作用强弱。该方法简便经济，是很便捷的初步筛选方法，但抗菌试验的结果易受外界因素影响。为了避免纸片琼脂扩散法抑菌物浓度不同对扩散的影响和比浊法受中药颜色的影响等因素，本实验采用纸片琼脂扩散法和试管稀释法同时进行抑菌实验研究[5-6]。纸片法通过不断将药物水分挥发，增大纸片载药量，实验结果最终有抑菌圈出现，但与试管稀释法对比，其结果有出入，原因为纸片载药量达到饱和，载药量达不到设计的载药量[7]。本抑菌实验误差来源主要有：①方法误差，选用纸片法在试验过程上受纸片的质量、纸片含药的准确性和均匀性影响较大，这是导致实验数据出现误差的最重要因素；②比浊法容易受药物颜色的影响，导致实验数据出现误差。

本实验在对白簕多糖进行抑菌研究过程中发现，白簕多糖样品含有杂菌。本研究严格按照微生物实验操作规定，经过4次重复实验，此现象仍旧存在。将白簕多糖进行试管稀释法实验后，肉眼观察均发现每组试管都呈混浊状态，将每组前3支试管分别在固体培养基上划线进行分离培养，结果通过肉眼可直接发现固体培养基上均长满细菌，且可明确看到所长的菌非原来所培养的细菌种类。将白簕多糖样品单独滴于在平板固体培养基上，经24h培养后，培养基上生长出细菌，证明样品本身含有细菌。白簕多糖出现此结果可以排除体外抗菌实验的操作问题。根据实验探究结果和近代多糖研究方法进展[12]，白簕多糖体外抑菌实验出现此结果的因素可能有以下4点：①在提取白簕的过程中，白簕多糖受到外界细菌的污染，且提取温度只有80℃，未达到100℃，不能满足灭菌规定的温度；酶法除蛋白过程中温度虽达100℃，时间却只有10s，不足以将细菌杀灭，导致在体外抗菌实验中出现杂菌；②药材自身存在细菌；③滤纸片法采用倒置培养，培养基表面的水分能满足细菌的生长，而多糖作为大分子扩散所需水分多，培养基表面的水分不能让多糖扩散，使其留在纸片上，不能对微生物生长产生作用；④琼脂培养基可能对多糖分子有一定的吸附作用，多糖不能摆脱而扩散不好。所以，白簕多糖的体外抗菌实验仍旧需要进行探究。

由纸片扩散法和试管稀释法实验结果可知，白簕总黄酮的醇洗脱物与水洗脱物皆对实验的5种细菌有抑菌活性，但皆远弱于抗生素的抑菌活性。是否用大剂量的药材就能发挥相应的效果呢？因没有继续研究随着浓度的增大，其抑菌能力的强弱变化，这需要今后进一步深入研究。本实验结果尚不能完全代表白簕总黄酮对其他致病菌有抑制作用，因此白簕总黄酮对其他致病菌有无抑制作用有待于进一步研究。

[1] 中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴[M]. 第2册.北京:科学出版社，1985：1037.

[2] 杨慧文,张旭红,梁嘉君,等.白簕叶黄酮的提取纯化及其抗炎作用初探 [J].食品工业科技,2014,35(8):295-298.

[3] TY PH D, LISCHEWSKIM, PHIET H V, et al. Two Triterpenoid Carboxylic Acidsfrom Acanthopanax Trifoliatus[J]. Phytochemistry, 1984, 23(12): 2889-2891.

[4] PARK SY,CHANG SY,OH OJ，et al.Nor-Oleanene Type Triterpene Glycosides from the Leaves of Acanthopanax Japonicus[J].Phytochem,2002,59(4):379-384.

[5] 郭丽霜,葛立男,宋宝辉，等.中药体外抑菌实验检测方法的比较[J].中医学报，2011,26(161):1207-1208.

[6] 唐亮,刘翠艳,韩春杨,赵宏坤，等.中药研究常用三种体外抑菌方法的比较[J].中国中医药科技,2011,18(5):419-420.

[7] 刘春兰,杨逸,何林，等.植物多糖抑菌作用研究方法进展[J].时珍国医国药,2013,24(7):1725-2727.

(责任编辑：宋勇刚)

Research of Antimicrobial Test about Flavonoids and Polysaccharide fromAcanthopanaxTrifoliatus

Wang Yan，Shi Yingqiao， Pan Yufang*
(Guangdong Pharmaceutical University, Zhongshan 528458, China)

Objective:To research the bacteriostatic action of the polysaccharide and flavonoids extract ofAcanthopanaxTrifoliatus, which were eluted with alcohol, water on the common strains.Methods:This experiment is through used flavonoids extract alcohol elution parts, water elution from Acanthopanax Trifoliatus and polysaccharide extract to conduct disc diffusion method and test tube dilution method of common clinical bacteria, studying the bacteriostatic action of different ingredients.Results:AcanthopanaxTrifoliatusflavonoids extract alcohol elution ofB.subtilisandSalmonellatyphiminimal inhibitory concentrations (mic) was 0.131 3mg/mL, but 0.262 5 mg/mL forSh.dysenteriae,Escherichiacoli(E.coli),S.aureus; Water elution part of total flavonoids minimal inhibitory concentrations (mic) were 0.296 0 mg/mL.Conclusion:Flavonoids extract alcohol elution, water elution part ofAcanthopanaxTrifoliatushad bacteriostatic action for a variety of pathogenic bacteria in clinical.

AcanthopanaxTrifoliatus; Total Flavonoids; Polysaccharide; Antimicrobial Test; Minimal Inhibitory Concentration

2015-01-06

王艳(1981-)，女，广东药学院实验师，研究方向为生物活性物质。

潘育方(1966-)，男，广东药学院教授，研究方向为天然植物生物活性。E-mail: 279864335@qq.com

R285.5

A

1673-2197(2015)11-0037-03

10.11954/ytctyy.201511015