UPLC－MS／MS检测2种中兽药制剂中非法添加庆大霉素的研究

刘雪红，张秀芹，乔 颖，孟 晨，王 驰，陈 玲，季 磊，张艺多

（1.大连市兽药饲料监察所，辽宁大连116037；2.辽宁省兽药饲料监察所，沈阳110000）

UPLC－MS／MS检测2种中兽药制剂中非法添加庆大霉素的研究

刘雪红1，张秀芹2，乔 颖1，孟 晨1，王 驰1，陈 玲1，季 磊1，张艺多1

（1.大连市兽药饲料监察所，辽宁大连116037；2.辽宁省兽药饲料监察所，沈阳110000）

应用超高效液相色谱－串联质谱技术建立了兽用中药制剂穿心莲注射液和鱼腥草注射液中非法添加庆大霉素的检测方法。样品经水溶解后稀释，采用20 mmol／L七氟丁酸（HFBA）乙腈与20 mmol／L HFBA水溶液作为流动相进行梯度洗脱，经ACQUITY HSS PFP色谱柱分离，通过多反应监测模式进行测定。庆大霉素在0.02～2 μg／mL的范围内线性关系良好，相关系数0.9998。平均回收率为98.2%～100.3%，相对标准偏差小于2.4%。检测限为2 mg／mL，定量限为4 mg／mL，该法准确、简单、快速。

中兽药制剂；庆大霉素；超高效液相色谱－串联质谱

庆大霉素（Gentamycin）为氨基糖苷类抗生素，对各种肠杆菌科细菌有良好抗菌作用。在畜禽养殖中，一般用于治疗细菌性感染，例如流行性腹泻、仔猪副伤寒、仔猪黄白痢、禽大肠杆菌病、禽伤寒、副伤寒等肠道疾病。因其良好的治疗作用，被添加到一些兽用中药制剂中，以增加中药制剂的治疗效果。非法添加使得养殖户在不知情的情况下使用抗生素，不仅诱导畜禽产生耐药性，而且导致药物在动物源食品中的残留，危害人体健康。它在动物性食品中的残留对人体具有潜在危害，可引起听力减退、耳鸣或耳部饱满感等耳毒性反应，及肾毒性反应和神经肌肉阻滞等。目前，没有针对中兽药制剂中非法添加庆大霉素的检测方法，本文对该检测方法进行了研究。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备 电子天平RD－200，德国Sartorius公司；超声波清洗机；涡旋振荡器；XEVO TQ－S ACQUITY UPLC超高效液相色谱－串联质谱仪，配置电喷雾离子源，美国Waters公司；色谱柱ACQUITY HSS PFP，2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters公司。

1.2 药品与试剂

1.2.1 标准品 庆大霉素，批号30930 C14000200，含量94.4%，德国Dr.Ehrenstorfer公司产品。

1.2.2 供试品

1.2.2.1 阴性对照注射液 鱼腥草注射液：天长市天洋兽药有限公司，批号：140326；穿心莲注射液：成都科锐动物药业有限公司，批号：20140222，经检测均不含庆大霉素。

1.2.2.2 阳性添加注射液 分别按照1%、2%、4%的比例在阴性对照注射液中添加庆大霉素标准品，混匀。

1.2.3 试剂 乙腈色谱纯，七氟丁酸（HFBA）优级纯，水为符合GB／T 6682－1992规定的一级水。

1.2.4 标准贮备液的配制 准确称取庆大霉素标准品25 mg，以水定容至25 mL，混匀，即为1000 μg／mL的标准贮备液；4℃保存于塑料试管中，有效期为3个月。

1.2.5 标准工作液配制 精密量取1.2.4项下标准贮备液1 mL，置100 mL容量瓶中，以水定容至刻度。混匀，制成浓度为10 μg／mL的标准工作液，保存于塑料试管中。

1.3 测定方法

智慧社区建设必然面临智能化硬件、自动化基础设施、数据机房等设备的应用，耗能问题无法回避，5G的出现极大地减少了为提升网速和传输效率进行的网络布线和电力消耗，让能源、资源的利用更高效，使得智慧社区的能耗控制更加精准，设备反应更加及时，可以有效减少资源的浪费。

1.3.1 样品处理 精密移取中兽药注射剂5 mL，置100 mL容量瓶中，以水定容至刻度，超声5 min，精密移取溶液1 mL加水，定容至100 mL；精密移取1 mL加水，定容至50 mL，过0.22 μm滤膜后，加入1.5 μL HFBA于进样瓶中供测定用。

1.3.2 液相色谱条件 柱温30℃，进样量5 μL，梯度洗脱程序见表1。

1.3.3 质谱条件 离子扫描方式：正离子，检测方式：多反应监测，雾化器压力：0.7 MPa，干燥气流量：800 L／h，干燥气温度：400℃，毛细管电压：3000 V。定性、定量离子对和锥孔电压及碰撞能量见表2。

表1 梯度洗脱程序表

表2 定性、定量离子对和锥孔电压及碰撞能量表

1.3.4 标准曲线绘制 精密量取标准工作液逐级稀释，以水定容配制成浓度分别为0.02、0.05、0.2、0.5、2 μg／mL标准曲线溶液，加入1.5 μL HFBA于进样瓶中，混匀后上机测定。

2 结果

2.1 标准曲线 以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，标准工作液浓度（μg／mL）为横坐标。庆大霉素在0.02～2 μg／mL的范围内线性关系良好，标准曲线见图1。

图1 庆大霉素的标准曲线图

2.2 检测限和定量限 阴性对照注射液按1.3.1项的方法步骤处理后，测定结果表明，在相应的保留时间，阴性对照注射液对所测药物无干扰。添加庆大霉素标准品20 mg于5 mL阴性对照注射液中，经提取后测定，庆大霉素的信噪比均S／N＞10，表示方法的定量限为4 mg／mL。添加庆大霉素标准品10 mg于5 mL阴性对照注射液中，经提取后测定，庆大霉素的信噪比均S／N＞3，表示方法的检测限为2 mg／mL。两种对照注射液的阴性及添加庆大霉素定量限浓度MRM谱图分别见图2、图3。

图2 鱼腥草阴性对照注射液及添加庆大霉素定量限浓度MRM色谱图

图3 穿心莲阴性对照注射液及添加庆大霉素定量限浓度MRM色谱图

2.3 精密度试验 取0.2 μg／mL庆大霉素标准工作液重复进样6次，每次5 μL，记录峰面积，计算相对标准偏差RSD，结果表明6次重复进样的RSD为0.2%，外标法测定庆大霉素具有良好的重现性。

表3 添加不同浓度庆大霉素回收率及重复性试验结果表 （n＝6）

2.5 稳定性试验 取上述2.4项下制备的供试液，分别于0、2、4、6、8、12、24 h进样测定，记录峰面积。结果表明，样品溶液在24 h稳定性良好。

3 讨论与小结

3.1 检测方法的选择 庆大霉素的定量检测，常用微生物法、高效液相色谱法、高效液相串联质谱法等。其中微生物法，过程复杂费时，干扰较多，专属性较低［1］。高效液相色谱法，需要柱后衍生化，较为繁琐［2］。本文采用的LC／MS／MS法，灵敏度高、选择性强；且在本文色谱条件下，不到5 min便可将样品中的庆大霉素检测，测试快速，分析周期短。

3.2 中兽药制剂种类的选择 鱼腥草注射液具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋等功效，用于治疗痢疾、乳痈、淋浊等。穿心莲注射液具有清热解毒功效，主治肠炎、肺炎、仔猪白痢［3］。庆大霉素是一种常见的兽药产品，对各种肠杆菌科细菌有良好抗菌作用，常用于治疗仔猪黄白痢、腹泻等，在畜禽养殖中极可能被添加到中兽药制剂中增强抗菌疗效。故选穿心莲注射液和鱼腥草注射液作为检测对象。

3.3 样品处理方法的选择 中药制剂与肌肉、肝、血液等样品相比，无蛋白及脂肪的干扰，无需过固相萃取柱净化［4－5］。且中兽药制剂添加量较大，无需浓缩。按本文方法处理样品，无基质干扰，方法简单、快速，回收率高。

3.4 添加回收率试验浓度的选择 根据2种中兽药注射剂及庆大霉素的治疗用量，选择添加1%、2%、4%庆大霉素作为添加回收试验浓度，符合非法添加的实际情况，测定回收率及相对标准偏差。

本方法确立的超高效液相色谱－串联质谱技术，可检测中兽药注射剂鱼腥草注射液和穿心莲注射液中非法添加的庆大霉素。检测限及定量限均能满足要求。样品处理简单，快速，检测方法准确、可靠。

［1］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二○一○年版（一部）［S］.

［2］农业部1163号公告－7－2009.动物性食品中庆大霉素残留检测 高效液相色谱法［S］.

［3］中国兽药典委员会.兽药国家标准 化学药品、中药卷 （第一册）［S］.北京：化学工业出版社，2013.

［4］孙 雷，张 骊，黄耀凌，等.超高效液相色谱－串联质谱法检测动物源食品中8种氨基糖苷类药物残留［J］.质谱学报，2009，30（1）：60－64.

［5］张 强，廖工铁，寿 旦，等.用高效液相色谱法测定兔血浆中硫酸庆大霉素的含量［J］.上海：中国医药工业杂志，1995，15（4）：147.

（编 辑：侯向辉）

Detection of Illegally Added Gentamycin in 2 Kinds of Traditional Chinese Medicine for Animals by UPLC－MS／MS

LIU Xue－hong1，ZHANG Xiu－qin2，QIAO Ying1，MENG Chen1，WANG Chi1，CHEN Ling1，JI Lei1，ZHANG Yi－duo1
（1.Dalian Institute Veterinary Drug and Feedstuffs Control，Dalian，Liaoning116037，China；2.Liaoning Province Institute Veterinary Drug and Feedstuffs Control，Shenyang110000，China）

A method of Ultra－HPLC－MS／MS was developed to determine gentamycin illegally added in traditional Chinese medicine for animals.The samples were dissolved and diluted.The HPLC separation was performed on ACQUITY HSS PFP column with a linear gradient elution program of 20 mmol／L HFBA acetonitrile and 20 mmol／L HFBA aqueous solution as the mobile phase.Selective reaction monitoring was used for the selective detection.The linearity of gentamycin ranged from 0.02 to 2 μg／mL with coefficient 0.9998.The average recovery was within the range of 98.2%～100.3%andRSDwere less than 2.4%.The limit of detection was 2 mg／mL and limit of quantification was 4 mg／mL.The method was accurate，convenient and fast.

traditional Chinese medicine for animals；gentamycin；Ultra－HPLC－MS－MS

2014－10－22

A

1002－1280（2015）01－0041－04

S859.83

刘雪红，副主任药师，从事兽药及兽药残留的检验工作。E－mail：liuxuehongyi＠163.com