液质联用法测定猪肝中β－受体激动剂残留的不确定度评定

黄雪英，齐 敏，沈 丹，钟锦辉，胡麦玲，谭 诺

（广州市动物卫生监督所，广州510440）

液质联用法测定猪肝中β－受体激动剂残留的不确定度评定

黄雪英，齐 敏，沈 丹，钟锦辉，胡麦玲，谭 诺

（广州市动物卫生监督所，广州510440）

采用超高效液相色谱－串联质谱法（UPLC－MS／MS）测定猪肝中9种β－受体激动剂残留量，对标准溶液、标准曲线、样品称量、称量重复性、定容体积等因素进行分析，通过评定各不确定度分量及标准不确定度，得出9种β－受体激动剂的合成相对标准不确定度为5.60%～8.90%，影响较大的因素为标准曲线和测量重复性。

不确定度；β－受体激动剂；超高效液相色谱－串联质谱

β－受体激动剂可促进动物生长、抑制脂肪合成，提高瘦肉率，被用于饲养动物后，易在动物组织中残留，从而影响消费者身体健康。农业部明令禁止克仑特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、氯丙那林等16种β－受体激动剂用于动物饲养。根据农业部1025号公告－18－2008《动物源性食品中β－受体激动剂残留检测液相色谱－串联质谱法》［1］，可以同时检测动物源性食品中特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克仑特罗、妥布特罗和喷布特罗等9种β－受体激动剂残留量。一个完整的测量结果，除了给出被测量的最佳估计值之外，还应同时给出与该值相关的不确定度。为了更合理、更科学地表示测量结果，依据JJF1059.1－2012《测量不确定度评定与表示》［2］和CNAS－GL06∶2006《化学分析中不确定度的评估指南》［3］，本研究建立了一套液相色谱－串联质谱法测定猪肝中β－受体激动剂残留量不确定度的评定方案。

1 材料与方法

1.1 仪器 超高效液相色谱－串联四极杆质谱联用仪（Waters UPLC Xevo TQ）；旋涡仪（IKA）；固相萃取装置（Supelco）；氮吹仪（Organomation）；高速离心机（Beckman）；振荡器（YAMATO）。

1.2 试剂 乙酸铵、高氯酸、氢氧化钠、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、氨水，均为分析纯；甲醇、甲酸，均为色谱纯；实验用水为超纯水。

1.3 标准品 克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、喷布特罗（Dr.Ehrenstorfer GmbH），氯丙那林、妥布特罗（WITEGA）、西马特罗（Sigma Aldrich）、非诺特罗（Toronto Research Chemicals Inc.），纯度均大于98%。

1.3.1 标准储备液（100 μg／mL）的制备 分别准确称取0.01000 g（精确到±0.00001 g）的特布他林、西马特罗、沙丁胺醇、非诺特罗、氯丙那林、莱克多巴胺、克仑特罗、妥布特罗和喷布特罗标准品，用甲醇溶解并定容至100 mL，分别配制成100 μg／mL的标准储备液。

1.3.2 混合标准工作液（0.01 μg／mL）的制备 分别吸取0.1 mL的上述9种β－受体激动剂储备液（浓度100 μg／mL），置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即成浓度为1 μg／mL的混合标准溶液。

吸取0.1 mL浓度为1 μg／mL混合标准储备液，用0.2%甲酸水稀释到10 mL，可得到0.01 μg／mL的混合标准工作液。

1.3.3 空白添加标准曲线的制备 准确称取2 g（精确到0.01 g）空白试样于50 mL离心管内，分别称取 5份。分别向其中添加 50、100、200、400、1000 μL混合标准工作液（浓度0.01 μg／mL），制得浓度为0.25、0.5、1、2、5 μg／kg的空白添加试料。按测试样品处理步骤操作，供超高效液相色谱－串联质谱仪测定。

1.4 测定方法 称取2 g（精确到0.01 g）测试样品，加入乙酸铵缓冲溶液8.0 mL，于37℃避光酶解。酶解后高速离心分出上清液，并用高氯酸调pH后高速离心沉淀蛋白，将上清液转移出来。上清液用NaOH溶液调pH后，用乙酸乙酯10 mL和叔丁基甲醚5 mL分别萃取一次。合并两次萃取有机相，50℃ 下氮气吹干，用2%甲酸溶液溶解，过MCX固相萃取柱（60 mg／3 mL）净化，洗脱液氮气吹干后用0.2%甲酸水溶液1 mL溶解，0.2 μm滤膜过滤后上机测定。

2 测量模型

式中：X—试样中被测物的残留量，单位为微克每千克（μg／kg）；

C—样液中被测物的上机测试浓度，单位为纳克每毫升（ng／mL）；

V—净化液经氮气吹干后的定容体积，单位为毫升（mL）；试验中V＝1 mL；

m—供试样品质量，单位为克（g）；试验中m＝2.00 g。

考虑到实验过程中各种随机因素对测量结果的影响，在测量模型中引入重复性系数frep，建立样品中β－受体激动剂药物残留量不确定度测量模型如下

由测量模型可看出，影响测定结果不确定度urel（X）的主要因素有：由标准曲线计算样液中被测物的浓度C引入的不确定度urel（C），净化液经氮气吹干后定容体积引入的不确定度urel（V），称量样品引入的不确定度urel（m），整个实验重复性（包括提取净化过程和仪器进样）的不确定度通过urel（frep）来体现。

由此得到试样中被测物的残留量的相对标准不确定度urel（X）可由下式计算：

3 相对标准不确定度分量的评定

3.1 实验合成重复性的相对标准不确定度urel（frep）按实验方法平行测定某样品5次，测得样品含量为X1～X5，分别计算各药物平均值和标准偏差测定结果和计算数据见表1。

表1 重复性相对标准不确定度urel（frep）计算结果表

3.2 样液中被测物的上机测试浓度C的相对标准不确定度urel（C） 样液中被测物的上机测试浓度C的相对标准不确定度urel（C）由两部分构成，一是制备空白添加标准曲线产生的不确定度urel（Cs），一是标准曲线拟合出样液中被测物的浓度产生的不确定度urel（C0）。

3.2.1 制备空白添加标准曲线产生的不确定度urel（Cs）Cs的不确定度主要来源包括：制备标准储备液引入的不确定度u1（Cs）；配制混标工作液引入的不确定度u2（Cs）；向空白基质样品中添加标准溶液引入的不确定度u3（Cs）。

3.2.1.1 制备标准储备液引入的相对标准不确定度u1（Cs） 标准储备液的不确定度主要由标准品称量、定容和标准品本身的不确定度决定。

（1）标准品称量引入的相对标准不确定度u11（Cs）

称量标准品的天平最大允许误差为±0.05 mg，取均匀分布，天平称量引入的相对标准不确定度为：

（2）标准液定容引入的相对标准不确定度u12（Cs）

标准品配制使用的100 mL A级容量瓶允差±0.10 mL，取均匀分布，相对标准不确定度：

定容至容量瓶刻度的变动性：重复定容10次，标准偏差为 0.030 mL，相对标准不确定度ur，2（V100mL）＝0.030 mL／100 mL＝0.0003；

假定实验室温度在20℃±5℃，20℃时甲醇的体积膨胀系数［4］为1.1×10－3／℃，均匀分布，温度引起的相对标准不确定度

相对标准不确定度：

（3）标准品纯度引入的相对标准不确定度u13（Cs）

由供应商（或证书）提供的标准品纯度引入的相对标准不确定度分别为：西马特罗0.005，沙丁胺醇0.005，氯丙那林0.005，特布他林0.01，非诺特罗0.005，莱克多巴胺0.01，克仑特罗0.005，妥布特罗0.005，喷布特罗0.01。

3.2.1.2 制备混标工作液（0.01 μg／mL）引入的相对标准不确定度u2（Cs） 按1.3.2项制备混标工作液（0.01 μg／mL），用0.1 mL移液器吸取甲醇溶液2次，10 mL容量瓶用甲醇和水各定容1次。

（1）10 mL容量瓶导致的相对标准不确定度

10 mL容量瓶的相对标准不确定度计算方式类似3.2.1.1项中（2），允差为±0.02 mL，不确定度为定容重复性标准偏差0.015 mL；温度变动性：溶剂为甲醇时，引起的不确定度为溶剂为水时，引起的不确定度为（20℃时水的体积膨胀系数为2.1×10－4／℃）。

用甲醇配制成浓度为1 μg／mL的混合标准溶液时，10 mL容量瓶引入的相对标准不确定度为

用0.2%甲酸水配制成浓度为0.01 μg／mL的混合标准溶液时，10 mL容量瓶引入的相对标准不确定度为

（2）移液器导致的相对标准不确定度

用移液器导致的体积相对标准不确定度主要有3个分量：校准分量ur，1（V）、充液重复性变化分量ur，2（V）和温度变化分量 ur，3（V），计算方式类似3.2.1.1项中（2）。移液器的容量允许误差和测量重复性参考JJG 646－2006移液器检定规程［5］的要求。

使用移液器引起的体积相对标准不确定度ur（V）计算结果见表2。

表2 使用移液器引起的体积相对标准不确定度表

制备混标工作液（0.01 μg／mL）时，用100 μL移液器移取0.1 mL甲醇溶液两次，引入的相对标准不确定度为：

3.2.1.3 向空白基质样品中添加标准溶液引入的相对标准不确定度u3（Cs） 以添加浓度为1 μg／kg的空白添加标准试样为例，需移取200 μL混合标准工作液（0.01 μg／mL），加入2 g空白试样中制备而得。该体积导致的相对标准不确定度为0.0046（具体数据见表 2）。同理添加成 0.25、0.5、2、5 μg／kg等浓度时相对标准不确定度分别为0.0091、0.0040、0.0041、0.0037。

制备标准曲线引入的相对标准不确定度urel（Cs）分别为：西马特罗0.0163，沙丁胺醇0.0163，氯丙那林 0.0163，特布他林 0.0184，非诺特罗0.0163，莱克多巴胺0.0184，克仑特罗0.0163，妥布特罗0.0163，喷布特罗0.0184。

3.2.2 标准曲线拟合过程的相对标准不确定度urel（C0）添加5个不同浓度的混合标准样品0.25、0.5、1、 2、5 μg／kg，按样品处理步骤操作后上机，对应上机浓度0.5、1、2、4、10 ng／mL，每一浓度测定3次。各种化合物以上机浓度C为横坐标，谱图强度峰面积Y为纵坐标，拟合标准曲线，建立数学模型：Yi＝bCi＋a，计算各化合物线性方程的斜率、截距和相关系数，相关数据见表3。

表3 各化合物回归直线测量结果表

待测物 标准浓度／（ng·mL－1） 峰面积1 峰面积2 峰面积3 回归方程 相关系数沙丁胺醇0.5 405.024 383.739 368.33 1 573.495 535.341 638.013 2 1940.658 2171.454 2091.345 4 3038.117 3125.19 2907.594 10 10063.54 10296.07 10092y＝1029.6x－361.6 0.9874氯丙那林0.5 1125.286 1032.872 916.502 1 2899.197 2849.437 2938.887 2 7357.09 8197.32 8066.064 4 12925.25 13454.92 13082.16 10 29600.19 28976.34 29749.1y＝2930.4x＋621.6 0.9910特布他林0.5 585.687 643.101 541.462 1 1171.474 1165.059 1186.414 2 2193.133 2330.319 2242.498 4 4786.406 4999.125 4510.367 10 10590.47 10953.27 11216.83y＝1087.9x＋133.3 0.9970非诺特罗0.5 210.68 256.483 237.944 1 365.431 308.511 327.133 2 539.291 515.051 497.52 4 678.222 639.835 699.058 10 1254.06 1364.976 1296.057y＝108.4x＋233.3 0.9841莱克多巴胺0.5 580.691 427.939 449.666 1 1061.072 972.467 838.232 2 1488.638 1569.103 1487.979 4 5157.384 5200.734 4849.987 10 11348.5 11466.23 11315.78y＝1172.7x－223.4 0.9903克仑特罗0.5 1451.178 1314.141 1179.006 1 2363.752 2324.606 1974.859 2 4030.21 4034.107 3913.252 4 9356.196 9729.781 9013.767 10 19744.08 19879.11 19535.05y＝1956.2x＋476.1 0.9930妥布特罗0.5 2494.644 2450.379 2560.842 1 6625.915 6752.771 6646.904 2 16973.52 16652.32 17013.38 4 29532.29 29873.28 28732.03 10 68115.79 69721.36 67502.93y＝6834.7x＋855.2 0.9954喷布特罗0.5 233.052 214.376 235.84 1 346.299 347.864 409.514 2 795.891 476.065 570.434 4 1094.66 1335.984 1272.839 10 2996.746 2860.948 2832.191y＝282.0x＋81.1 0.9925

被测样品2次平行测定后，通过拟合直线求出SR和各化合物浓度C0，根据公式（1）计算出被测样品中所含各待测物残留量X0，按（3）式计算各待测物浓度的标准不确定度u（C0）。

其中Yi—标准溶液的峰面积测定值；

Ci—标准溶液的浓度值；

b—拟合直线的斜率；

a—拟合直线的截距；

n—标准溶液测试次数，本实验中n＝15；

p—C0测试次数，本实验中p＝2；

C0—由线性方程计算得各化合物浓度；

表4 浓度C的不确定度计算的有关量值表

3.3 定容体积的相对标准不确定度urel（V） 用移液器定容至1 mL，根据表2，urel（V）＝ 0.0037。

3.4 称量样品的相对标准不确定度urel（m） 称量样品的天平最大允许误差：±5 mg，采用均匀分布，2.00 g＝0.0014。

3.5 合成标准不确定度 urel（X）及扩展不确定度Urel（X） 根据公式（2）计算合成标准不确定度，取包含因子k＝2，则相对扩展不确定度Urel（X）＝k× urel（X），结果见表5。

表5 合成标准不确定度的有关量值表

4 不确定度报告

依据农业部1025号公告－18－2008对猪肝样品中β－受体激动剂残留量进行检测，对样品平行测定2次，取包含因子k＝2，测定结果见表6。

表6 猪肝中β－受体激动剂残留量检测结果表

5 结论

从以上分析数据可以看出，实验过程中，样品称量和最终定容体积引入的不确定度极小，可忽略不计，影响测定结果不确定度的主要因素为标准曲线和样品的测量重复性。所以测试过程中，要严格控制实验条件，保证标准曲线具有良好的线性以及实验具有良好的重复性，才能有效的保证检测结果的准确性。

［1］农业部1025号公告－18－2008.动物源性食品中β－受体激动剂残留检测液相色谱－串联质谱法［S］.

［2］JJF1059.1－2012.测量不确定度评定与表示［S］.

［3］CNAS－GL06：2006.化学分析中不确定度的评估指南［S］.

［4］李兰英，丁 敏，徐 勤，等.LC－MS／MS测定猪尿中盐酸克伦特罗不确定度的评定［J］.中国计量学院学报，2012，23（1）：7－12.

［5］JJG 646－2006.移液器检定规程［S］.

（编 辑：侯向辉）

Uncertainty Evaluation of β－Agonists in Pork Liver by Ultra Performance Liquid Chromatography－tandem Mass Spectrometry

HUANG Xue－ying，QI Min，SHEN Dan，ZHONG Jin－hui，HU Mai－ling，TAN Nuo
（Guangzhou Animal Health Inspection Institute，Guangzhou510440，China）

Evaluation on uncertainty of measurement in the determination of 9 kinds of β－agonists in pork liver by ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry was practiced.The main factors，including standard solution，standard curve，weighing of sample，measurement repeatability，and volume were evaluated.The combined uncertainty of 9 kinds of β－agonists was in the range of 5.60%～8.90%.The results showed that the measurement uncertainty was mainly due to the standard curve and measurement repeatability.

uncertainty；β－agonists；ultra performance liquid chromatography－tandem mass spectrometry（UPLCMS／MS）

2014－11－03

A

1002－1280（2015）01－0045－07

S859.84

黄雪英，硕士，从事兽药残留检测技术研究。E－mail：ssherry109＠163.com