HPLC-ELSD法测定硫酸庆大霉素含量的方法改进

陈志 李传响

HPLC-ELSD法测定硫酸庆大霉素含量的方法改进

陈志 李传响

目的建立HPLC-ELSD面积归一化法测定硫酸庆大霉素含量的测定方法。方法色谱柱为Inertsil ODS-SP(4.6 mm×250 mm/5 μm)；流动相：0.2 mol/L的乙酸-甲醇(93：7)；流速0.6 ml/min；柱温：30℃；蒸发光散射检测器Alltech 3300的飘移管温度为110℃；气体流速为2.6 L/min。结果硫酸庆大霉素各组分分离完全, 用面积归一化法测定庆大霉素的含量。结论方法简便快速, 准确度高,重现性好, 可有效控制药品质量

HPLC-EISD法；庆大霉素；面积归一化；含量

庆大霉素是氨基糖苷类广谱抗生素, 临床应用很广, 但是由于庆大霉素分子结构中不存在共轭体系, 不具备紫外吸收特性且成分复杂, 故其含量测定方法中国药典规定采用抗生素微生物检定法中的二剂量法测定, 该方法不但操作繁琐复杂, 对操作人员熟练技能要求高, 重现性差。有文献报道过采用衍生化法［1］、氧化还原法［2］测定其含量, 也有采用HPLC-ELSD方法［3］测定庆大霉素组分。为此作者参考有关文献资料［4-6］在现在有的HPLC-ELSD检测方法的基础上进一步优化庆大霉素含量测定的方法。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT型高效液相色谱仪, (包括CDM-20A控制器, SIL-20A自动进样器, CTO-20AC柱温箱), Alltech 3300型蒸发光检测器。岛津Inertsil ODS-SP(4.6 mm×250 mm)色谱柱。庆大霉素标准品(130326-201015 630 U/mg, C1 27.1%；C1a 25.3%;C2 30.1%;C2a 17.4%);硫酸庆大霉素注射液(A厂家：13020218；1111201；1112251； B厂家：13030516；12071211；11092201)甲醇(色谱纯)乙酸(分析纯)。

2 方法

2.1色谱条件 色谱柱Insetsil ODS-SP(4.6 mm×250 mm/5 μm)流动相：0.2 mol/L的乙酸-甲醇(93：7)；流速0.6 ml/ min；柱温：30℃；蒸发光散射检测器Alltech 3300的飘移管温度为110℃；气体流速为2.6 L/min。进样量20 μl。

2.2溶液的制备 精密称取小诺霉素标准适量, 加水溶解并稀释成每1 ml中含0.2、0.5、1.0 mg的溶液作为小诺霉素标准品溶液。精密称取庆大霉素标准品适量, 加水溶解并稀释成每1 ml中含0.2、0.5、1.5 mg的庆大霉素标准品对照液。取硫酸庆大霉素注射液适量, 加水稀释成每1 ml含硫酸庆大霉素2.5 mg的溶液, 作为供试品溶液。

2.3系统性试验 分别取庆大霉素和小诺霉素标准品各适量, 加水溶解并稀释成每1 ml含庆大霉素1.0 mg与小诺霉素0.2 mg的混合溶液, 取20 μl注入色谱仪, 照2.1的色谱条件测定, 记录图谱, 出峰顺序从第二个主峰开始计, 依次为：西索米星, 庆大霉素C1a, C2, 小诺霉素, C2a, C1；小诺霉素和C2, C2a之间的分离度应符合要求, 小诺霉素峰面积的相对标准差应<2.0%。见图1。

2.4方法学验证 专属性验证：取2.2项下的溶液照2.1项的色谱条件进样记录色谱图。

重复性验证：取硫酸庆大霉素标准品溶液照2.1项下的色谱条件测定6次, 以面积归一化法计算各组分的含量。

2.5样品含量的测定 取2.2项下制备的供试品溶液, 照2.1项的色谱条件进行测定, 并记录色谱图, 直接进行峰面积归一化法(硫酸峰除外)计算庆大霉素各组分的总含量。同时与抗生素微生物检定法做对比。

3 结果

3.1专属性验证结果 结果显示, 庆大霉素的各个组分与小诺霉素的分离度都能达到要求, 达到基线分离。见图1。

3.2重复性验证结果 结果显示, 庆大霉素的组分C1a、C2、C2a、C1的含量RSD分别为：0.6%、0.5%、0.7%、0.7%(n=6)。

3.3样品含量测定结果 结果见图2, 表1。

图1 硫酸庆大霉素各组分与小诺霉素分离度

表1 硫酸庆大霉素样品含量测定对比表(%)

3 讨论

3.1溶剂与流动相选择, 硫酸庆大霉素、西索米星、小诺霉素都是易溶于水的物质, 且在实验中发现水与流动相对庆大霉素含量测定没有差别, 故选择水为溶剂。文献资料在测定庆大霉素C组分时, 采用的流动相是0.2 mol/L的三氟乙酸-甲醇, 而作者在经过大量比对试验后发现, 采用0.2 mol/L的乙酸-甲醇(93:7)为流动相, 也能达很好的分离效果, 而且还可以降低三氟乙酸带来的实验室毒性, 降低实验成本, 故本文选用0.2 mol/L乙酸-甲醇(93:7)为流动相。

3.2由于庆大霉素是由微生物发酵提取而得, 组分多而复杂, 其中庆大霉素主要以4个组分为主, 发酵液中的其他组分如西索米星、小诺霉素与庆大霉素有大致相同的抗菌谱。只是不同厂家的生产发酵提纯工艺不同, 会导致庆大霉素的主要组分含量也不一致。而微生物法是通过抑菌能力而评判其效价含量, 其中也包括小诺霉素、西索米星的抑菌作用,在用微生物法测定时, 庆大霉素供试品可能与庆大霉素标准品的抑菌效果不尽相同, 也就可以间接解释, 用二剂量法测定庆大霉素含量时, 效价偏低, 差异较大现象。而面积归一化法相比对数线性回归法、微生物法［3］, 不仅可以避免计算复杂, 操作繁琐, 还可以更准确快速地通过测定庆大霉素4个组分的所占的比例, 更好地控制庆大霉素的产品质量, 快速简便地监控和改进生产发酵提纯工艺。

图2 硫酸庆大霉素样品的测定

3.3采用本文描述的面积归一化法测定硫酸庆大霉素含量时, 关键在于系统性试验要达到基线分离的要求, 因此, 试剂选择、条件设置以衣流动相比例应配制准确。

［1］ 中华人民共和国药典委员会.中国药典.2000版二部.北京:化学工业出版社, 2000:866.

［2］ British Pharmacopoeia Commission.British Pharmacopoeia 2007.London:The stationary Office , 2007:753.

［3］ 中华人民共和国药典委员委会.中国药典.2010年版二部.中国医药科技出版社, 2010:976.

［4］ 张建革, 刘英, 王立萍.HPLC-ELSD测定硫酸庆大霉素注射液含量及其有关物质的研究.华西药学杂志, 2010, 25(1):80-82.

［5］ 熊雯, 袁涛.HPLC-ELSD测定硫酸庆大霉素有关物质及其C组分质量标准的改进.中国抗生素杂志, 2011, 36(10):775-777.

［6］ 高燕霞, 姜建国, 张西如.高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定硫酸庆大霉素注射剂中有关物质.中国药业, 2010, 19(6):20-21.

Improvement of determination of gentamicin sulfate content by HPLC-ELSD

CHEN Zhi, LI Chuanxiang.Anqing Medical College, Anqing 246001, China

Objective To establish a method for the determination of gentamicin sulfate content by HPLCELSD method.MethodsA C18 column was used, the mobile was 0.2mol/L Acetic Acid-methanol(93:7), the flow was 0.6ml/min the detecter was ELSD .The temperature of drift was 110℃ and flow rate of carrier gas was 2.6 L/min.RusltsThe gentamicin sulfate was sperated from its related substance completely.The Norm of peak area technique could be used to determine the gentamicin sulfate.ConclusionThe method is simple and convenient, accurate, sensible an reproducible.This method is suitable for the quality control of the gentamicin sulfate.

HPLC-EISD method; Gentamicin; Normalized peak area technique; Content

246001 安庆医药高等专科学校(陈志)；安庆市食品药品检验所(李传响)