基于熵权相似度计算法的“江栀子”指纹图谱研究*

★ 吴璐 黎晓丽 刘婧 方建和 杨华生＊ (江西中医药大学 南昌330004)

栀子为茜草科植物栀子(Gardenia jasminoidesEllis.)的成熟果实，始载于《神农本草经》，为中国药典［1］各版收载的品种，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒等功效。栀子为江西道地药材，在我国应用广泛。近年来，指纹图谱分析技术由于具有适合从整体上分析复杂化学物质成分的特点，已被美国［2］、WHO［3］、欧盟［4］等国家和组织接受，并用来评价天然药物质量。目前相似度计算多采用相关系数法或夹角余弦法(相合系数法)。但这两种方法计算所得的相似度只与各成分之间含量的比值相关，可能会因为不同成分含量的变化而掩盖了某些特征峰的个性信息，导致其对样本的区分能力较弱。基于这些缺陷，本研究对传统的指纹图谱建立方法进行改进，开发了熵权法用于指纹图谱相似度的计算，并在中药“江栀子”上进行了实际应用，成功建立了基于熵权法的“江栀子”药材指纹图谱相似度分析方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent化学工作站(美国);赛多利斯BS 110S型电子分析天平(北京赛多利斯公司)。KQ-250型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试药 栀子苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号110749-201316)，栀子对照药材(中国食品药品检定研究院，批号120986-201309)。乙腈(色谱纯，国药集团化学试剂有限公司)、水为双蒸水，其他试剂均为分析纯。20批栀子药材(编号1～20)产地均为江西，经江西中医药大学付小梅副教授鉴定为茜草科植物栀子(Gardenia jasminoidesEllis.)的成熟果实。

2 方法与结果

2.1 利用信息熵改进指纹图谱相似度的计算方法

指纹图谱的相似度计算一般采用相关系数(r)或相合系数法(ρ)，两者能快速、较好地通过完整指纹图谱或色谱峰面积(峰高)计算指纹图谱的相似程度。其计算公式如下:

其中xi为某个样品对应保留时间下的峰面积或峰高，xj为n批样品(n大于等于10)对应保留时间下的平均峰面积或峰高，k=1-m，m表示色谱峰数。利用信息熵计算各色谱峰的权重因子，相关系数与相合系数得到优化后的计算公式如下:

公式(6)其中Pij表示第j个样品指纹图谱在第i个共有峰总面积中的“概率”。

2.2 色谱条件 Kromasil色谱柱(4.6mm×250mm，5μm);乙腈(A)-水(B，含0.2%磷酸)为流动相，梯度洗脱，洗脱程序为:0～10min 6%A，18 min 12%A，22 min 16%A，28 min 20%A，40 min 20%A，60min 36%A，65 min 55%A;平衡时间10 min;流速为1 mL/min;检测波长为238 nm，参比波长为580nm;柱温为30℃;进样量为5μL。

2.3 样品的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含栀子苷0.8mg的对照品溶液，即得。

2.3.2 供试品溶液的制备 按照文献方法，分别从溶剂、提取方法2方面考察供试品溶液制备方法。以栀子苷对照品的加样回收率结果为参考，确定最优制备条件:取本品粗粉约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25mL，称定重量，超声(300W，100Hz)提取30min，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

2.4 指纹图谱建立的方法学考察

2.4.1 仪器精密度试验 取对照药材，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下方法连续测定5次。所有共有峰(占总峰面积90%)的相对峰面积和相对保留时间的RSD均分别小于2.5%，5个指纹图谱相关系数均大于0.95，表明仪器稳定，精密度良好。

2.4.2 方法重复性试验 取对照药材，按2.3.2项下方法制备供试品溶液5份，按2.2项下方法测定。所有共有峰(占总峰面积90%)的相对峰面积和相对保留时间的RSD均分别小于2.5%，5个指纹图谱相关系数均大于0.95，表明方法的重复性良好。

2.4.3 样品稳定性试验 取对照药材，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下方法分别在0、6、12、18、24h进行测定，栀子苷色谱峰峰面积RSD均小于2.5%，同时指纹图谱所有共有峰(占总峰面积90%)的相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于2.5%，指纹图谱相关系数均大于0.95，表明供试品溶液在24h内基本稳定。

2.5 样品指纹谱图的建立 取对照药材及20批药材样品，按2.3.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下方法进行测定，得到标准指纹图谱和20批栀子药材的指纹图谱，如图1～3所示。

图1 对照品图谱

图2 对照药材指纹图谱

图3 20批药材指纹图谱

2.5 基于熵权法的“江栀子”指纹图谱相似度研究

根据分离度高、特征性强的原则，筛选出11个色谱峰，11个共有峰的最小分离度均大于1.5，栀子苷对照峰(7号峰)的理论塔板数大于3000。以栀子对照药材的指纹图谱为标准模式，以栀子苷为对照峰计算各峰的相对峰面积，以面积归一化法计算各峰的相对百分含量，把信息熵引入了相似度算法确定各特征峰的权重(表1)，并计算出各样品与江栀子标准模式的相似度(表2)。

表1 各特征峰的权重

表2 熵权法与传统方法的相似度计算结果比较

由图3与表1可知，加权的方法能够较好地反映出各特征峰的重要程度，其中7号栀子苷峰因其在共有指纹峰中所占面积比例大，分散度小，其相对权重被大大降低，而2、6、8号峰因它们的分布较为分散，相对权重较大，反映了它们对整体判断的重要性。以栀子对照药材的指纹图谱作为标准图谱，20批样品用传统相似度计算法和熵权相似度计算法算得的相关系数与相合系数均在0.95以上，说明江西产栀子药材的化学组成一致性较好，质量较稳定，道地性强。

3 讨论

本研究曾考察了甲醇、75%甲醇、乙醇、75%乙醇4种提取溶剂及不同提取时间的提取效果，结果75%甲醇超声提取30min的提取效果最好。分别考察了甲醇-水及乙腈-水流动相系统，结果表明乙腈-水系统分离效果较好，各峰的保留时间适中，分离度较好，且基线稳定，有利于指纹图谱的分析。

用传统的相似度算法来进行中药材指纹图谱分析时，当某些成分较其它成分含量高很多，且批次之间变化不明显时，人们往往忽略了指纹图谱中那些低含量成分峰面积变化对指纹图谱整体的影响，从而导致对药材道地性的误判，如何有效地反映各成分对指纹图谱变化的影响程度，是解决问题的关键。把信息熵加权的方法引入相似度算法中，获得各色谱峰的权重，不仅可以直接采用所有色谱峰(或全谱)数据来计算，而且使所得的相似度更加客观合理。本研究结果表明，利用熵权相似度计算法研究“江栀子”指纹图谱、识别其道地性是可行的，本法为“江栀子”道地性识别提供了又一种科学的参考，扩展了指纹图谱的应用领域。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典·一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:231.

［2］CDER.Guidance for industry botanical drug products［Z］.Rockville:FDA，2004.

［3］WHO.Guidelines for the Assessmen to fherbal medicines［Z］.Geneva:WHO，1991.

［4］HMPWP.Final proposals for Revision of the Note for Guidance on Quality of Herbal Remedies［Z］.London:EMEA，1998.

［5］吴璐，杨华生.基于信息熵理论的中药提取工艺研究［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18(9):29-31.

［6］邱菀华.管理决策与应用熵学［M］.北京:机械工业出版社，2002:10.