表皮生长因子受体基因在非小细胞肺癌原发灶与淋巴结转移灶中的突变情况分析及临床意义

卿松 刘铭 师艺 王玻玮 马遇庆

新疆医科大学第一附属医院病理科，新疆乌鲁木齐830054

表皮生长因子受体基因在非小细胞肺癌原发灶与淋巴结转移灶中的突变情况分析及临床意义

卿松 刘铭 师艺 王玻玮 马遇庆▲

新疆医科大学第一附属医院病理科，新疆乌鲁木齐830054

目的探讨表皮生长因子受体（EGFR）基因在非小细胞肺癌（NSCLC）原发灶及淋巴结转移灶中的突变情况，分析其在不同病灶中的突变率与临床病理特征的关系。方法采用实时荧光聚合酶链反应（RT-PCR）的TaqMan探针法检测50例NSCLC原发灶及淋巴结转移灶中EGFR基因突变情况，并通过统计软件分析其与临床病理特征的相关性。结果50例NSCLC原发灶中，EGFR基因突变率为38.0%（19/50），与性别、病理组织学类型、吸烟关系密切（P＜0.05），与年龄、分化程度、部位、民族、临床分期无关（P＞0.05）；在淋巴结转移灶中的突变率为22.0%（11/50），与原发灶EGFR基因突变率比较差异有统计学意义（P＜0.05），而与其他临床病理特征无关（P＞0.05）。结论EGFR基因突变主要集中于女性、肺腺癌、非吸烟患者，并且在NSCLC原发灶及淋巴结转移灶中突变不一致，表现出肿瘤的异质性，影响疗效。

表皮生长因子受体；非小细胞肺癌；原发灶；淋巴结转移灶；实时荧光聚合酶链反应

肺癌以其高发病率和病死率位居各种常见恶性肿瘤的第一位，全球每年新增患者为160万例，而死亡患者高达138万例[1-2]。我国每年新增肺癌患者70余万人，其中70%～80%为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），2/3的患者初诊时已为中晚期，失去了手术机会[3]，而采用传统含铂双药化疗预后不佳。随着Lynch等[4]和Paez等[5]首次报道了表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突变可进行药物靶向治疗后，NSCLC进入了分子靶向的个性化治疗时代，中晚期患者的预后明显改善，但由于肿瘤的异质性，患者疗效不尽相同。本研究检测EGFR基因在NSCLC原发灶及淋巴结转移灶中的突变情况，分析其突变与临床病理特征的关系，辅助临床的后续靶向治疗。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集新疆医科大学第一附属医院2012年4月～2014年12月经病理检查确诊为NSCLC的50例病例的存档切片、蜡块及相关临床资料，并且每例病例均包括肿瘤原发灶及配对的淋巴结转移灶。50例病例中女19例，男31例；年龄35～78岁，平均（61.3± 10.7）岁；其中≤60岁有20例，＞60岁有30例；NSCLC病理学类型：鳞状细胞癌14例，腺癌36例；肿瘤分化程度：高中分化33例，低分化17例；临床分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期10例，Ⅲ期12例，Ⅳ期17例，肿瘤部位：左叶21例，右叶29例；民族：维吾尔族患者3例，汉族患者47例；19例采用靶向药物治疗，31例采用传统药物治疗；有吸烟史的患者30例（＞5支/d）；随访时间截至2015年1月，共有21例健在，25例死亡，4例失访。本研究经医院伦理委员会通过，临床资料及石蜡标本均获患者同意后使用。

1.2 主要仪器及试剂

ABI-7500定量PCR仪（美国ABI公司），NanoDrop-2000超微量分光光度计（美国NanoDrop公司）；石蜡组织DNA提取试剂盒（QIAamp DNA Mini Kit，德国QIAGEN公司），人EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR）（中国北京雅康博生物科技有限公司）。

1.3 石蜡DNA提取及浓度测定

按照QIAamp DNA Mini Kit操作步骤：常规切片4 μm厚10张，脱蜡、水化、烘干，加入裂解液、蛋白酶K后55℃水浴箱过夜，离心后取上清液。使用Nano-Drop-2000测定波长260/280 nm处的吸光度（A）值，确定DNA的纯度和浓度。

1.4 实时荧光聚合酶链反应（RT-PCR）

采用RT-PCR的TaqMan探针法检测NSCLC中EGFR基因18、19、20、21外显子特定区域突变型基因。按照人EGFR基因突变检测试剂盒（荧光PCR）的实验步骤进行，反应体系为25 μL∶3.0 μL TaqMan Universal Master Mix 2X，3.0 μL DNA模板，19 μL检测试剂Ⅰ。反应条件：95℃反应10 min（1个循环）；95℃反应15 s，60℃反应60 s，以上2个步骤进行40个循环。每次试验均设定阴性、阳性对照及空白对照。根据样本扩增曲线及相应Ct值，检测结果判断标准如下：没有出现扩增曲线或Ct值=0的样本为阴性样本，出现扩增曲线且Ct值＜34.0的样本为阳性样本，出现扩增曲线且34.0≤Ct值≤38.0的样本重做，若重做结果与原结果近似则判定为阴性样本。

1.5 统计学方法

数据采用SPSS 17.0软件进行分析。EGFR基因在各组间的突变率及与临床病理特征相关性分析采用χ2检验，单因素生存分析采用乘积极限法（Kaplan-Meier），以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC原发灶和淋巴结转移灶中EGFR基因突变情况分析

本研究采用RT-PCR的TaqMan探针法对50例NSCLC的原发灶和淋巴结转移灶进行检测，结果显示EGFR基因在NSCLC原发灶中总突变率为38.0%（19/50），其中第19号外显子突变率为22.0%（11/50），均为缺失突变，第21号外显子突变率为16.0%（8/50），均为L858R突变。在NSCLC淋巴结转移灶中总突变率为22.0%（11/50），其中第19号外显子突变率为8.0%（4/50），均为缺失突变，第21号外显子突变率为14.0%（7/50），均为L858R突变。EGFR基因在NSCLC原发灶的突变率要高于淋巴结转移灶的突变率，差异有统计学意义（P=0.008）。见表1。

表1 EGFR基因突变在NSCLC原发灶与淋巴结转移灶之间的比较（例）

2.2 NSCLC原发灶和淋巴结转移灶中EGFR基因突变情况与临床病理特征之间的关系

NSCLC原发灶中，EGFR基因在女性中的突变率要高于男性，在腺癌中的突变率高于鳞状细胞癌，同时，EGFR基因在不吸烟患者中的突变率高于吸烟患者，以上差异均有统计学意义（P＜0.05），而与年龄、分化程度、部位、临床分期、民族无关（P＞0.05）。EGFR基因在淋巴结转移灶中的突变率与性别、年龄、组织学类型、分化程度、部位、临床分期、民族均无关（P＞0.05）。见表2。

2.3 靶向药物治疗及传统药物治疗与患者预后关系

原发灶中19例EGFR基因突变患者均采用靶向药物（吉非替尼或厄洛替尼）治疗，31例未突变的患者均采用传统治疗，靶向药物治疗组的平均生存期为（16.0±4.9）个月，传统药物治疗组平均生存时间为（10.0±4.1）个月。通过Kaplan-Meier法比较两组患者的生存期，发现靶向药物治疗组患者的生存时间明显高于传统药物治疗组的生存时间，差异有统计学意义（χ2=5.570，P=0.018）（图1）。而11例淋巴结转移灶EGFR基因突变患者中有10例采用了靶向药物治疗，其生存时间与31例传统药物治疗生存时间比较，差异无统计学意义（χ2=3.015，P=0.083）。

表2 EGFR基因在NSCLC原发灶及淋巴结转移灶中的突变情况与临床病理特征之间的关系（例）

图1 非小细胞肺癌原发灶中靶向及传统药物治疗与患者生存曲线

3 讨论

EGFR在正常肺组织内表达率很低，但在53%～70%的NSCLC中呈阳性表达[6]，其为酪氨酸激酶受体，分子量为170 000 D，位于染色体7q12上[7]，突变主要发生在编码激酶区域的外显子（18～21号外显子）上[8]，EGFR基因突变被认为是应用EGFR酪氨酸激酶抑制剂（epider-mal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI）治疗中晚期NSCLC患者的前提条件，目前使用最多的一线药物有吉非替尼、厄洛替尼等。随着靶向药物的使用，使中晚期NSCLC患者的中位生存期由原来传统药物治疗的8～11个月延长到18～30个月[9-11]，预后得以改善。

本研究采用RT-PCR的TaqMan探针法对伴有淋巴结转移的50例NSCLC病例的原发灶及淋巴结转移灶分别行EGFR基因检测，结果显示原发灶中EGFR基因突变率为38.0%，此结果与之前研究报道[12]EGFR基因在亚洲人群中的突变率38.1%～59.0%接近，并与国内林芳等[13]、张怡浞等[14]研究中EGFR基因的突变率相似。徐慧英等[15]、谢静等[16]研究中EGFR基因突变主要集中在19号外显子缺失突变及21号外显子的L858R突变，本研究中NSCLC原发灶的19例和淋巴结转移灶的11例EGFR基因突变类型均为19号外显子缺失及21号外显子的L858R突变，与上述研究结果相似。本研究结果显示原发灶中EGFR基因在女性中的突变率要明显高于男性，与赵瑾等[17]结果类似，并且EGFR基因的突变率在非吸烟患者中明显高于吸烟患者，差异显著。此前，Sun等[12]也报道在亚洲非吸烟女性的EGFR基因突变率要高于其他患者，说明性别和吸烟史对EGFR基因突变有着重要影响，但考虑到亚洲地区女性吸烟率远低于男性，张怡浞等[14]通过多因素分析显示吸烟是EGFR基因突变的主要影响因素，而性别不是其影响因素。本组研究同样显示出EGFR基因突变率跟NSCLC病理组织学分型密切相关，在肺腺癌中的突变率明显高于肺鳞状细胞癌，与之前报道相符[9,12,15]。Kawaguchi等[18]研究发现EGFR在不同种族的突变率有差异，在亚裔患者的突变率约为30.0%，而高加索裔患者仅为10.0%。申红丽等[19]对新疆维吾尔族及汉族患者的EGFR基因突变率进行研究，发现新疆维吾尔族患者的突变率为10.8%，汉族患者的突变率为44.2%，由于新疆维吾尔族与高加索人种接近，故在上述两项研究中突变率接近，同时汉族与维吾尔族患者的突变率有显著性差异。但在本研究中EGFR基因在维吾尔族患者中未突变，在汉族中的突变率（38.0%）低于申红丽等[19]的研究，而且汉族与维吾尔族患者的突变率无差异，主要原因与本研究组的研究对象相对较少且维吾尔族患者过少有关，有待增加观察对象及少数民族患者后进一步研究。

本研究中，EGFR基因在淋巴结转移灶中有11例突变阳性，突变率为22.0%，低于原发灶中的突变率（38.0%），差异有显著性，表明在本研究中EGFR基因的突变主要发生在原发灶。但目前关于EGFR基因在原发灶和转移灶中突变的研究结果不尽相同，如在Chang等[20]的研究中，EGFR基因在原发灶和淋巴结转移灶中的突变率分别为28.6%及33.9%，王帅等[21]研究中在原发灶和脑转移灶的突变率分别为38.7%及35.5%，均存在差异，但差异不明显。而冷再君等[22]研究中转移灶的突变率（58.6%）较原发灶（35.6%）高，有显著性差异，与本研究结果相反，产生此类现象的原因估计与研究对象的数量及选取标准有关。同时，本研究发现在原发灶和淋巴结转移灶中突变的EGFR基因存在不一致现象，有10例在原发灶和淋巴结转移灶中突变的EGFR基因保持一致，但有9例原发灶EGFR基因突变阳性而在淋巴结转移灶中丢失，另有1例淋巴结转移灶中EGFR基因突变阳性但在原发灶中呈野生型，与之前报道类似[14,20-22]。这种现象表明在肿瘤的转移过程中，肿瘤细胞通过克隆演进而获得了不同的表型，显示出肿瘤的异质性，并对同一种靶向药物有不同的反应，影响疗效。就如本组患者所表现出的，虽然靶向药物治疗可明显延长患者的生存时间，但分别分析靶向药物对原发病灶和淋巴结转移灶的疗效后发现，在原发灶中靶向药物的治疗对延长生存时间起着显著作用，而在淋巴结转移灶中所起的作用就没有那么明显，两者疗效上的差异为肿瘤异质性的体现，具体可表现在患者生存时间上，本研究中靶向药物治疗患者的平均生存时间为（16.0±4.9）个月，低于文献[9-11]中的18～30个月，与本组患者均伴有淋巴结转移灶、存在肿瘤异质性而影响疗效有关，在传统治疗组中由于其药物作用机制不同，所受影响不明显，平均生存时间为（10.0±4.1）个月，与文献[9-11]中8～11个月接近。

综上所述，本研究中EGFR基因突变率在原发灶中与性别、组织学类型、吸烟密切相关，而在原发灶和淋巴结转移灶中表现出肿瘤的异质性，影响预后，今后随着对肿瘤异质性的深入研究，将会对临床采用个性化靶向治疗提供进一步理论依据。

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Analysis of mutations situation and clinical significance of epidermal growth factor receptor gene in primary focus and metastatic focus of non-small cell lung cancer

QING SongLIU MingSHI YiWANG BoweiMA Yuqing▲
Department of Pathology,the First Teaching Hospital of Xinjiang Medical University,Xinjiang Uighur Autonomous Region,Urumqi830054,China

Objective To investigate the mutations situation of epidermal growth factor receptor(EGFR)gene in primary focus and metastatic focus of non-small cell lung cancer(NSCLC),and to analyze the relationship of the mutation rate of it in different focus and clinicopathologic feature.Methods The TaqMan probe method of real-time polymerase chain reaction(RT-PCR)was used to detect the conditions of EGFR gene mutation in primary focus and metastatic focus of 50 cases with NSCLC,and its correlation with clinicopathologic feature was analyzed through statistical software.Results Among the primary focus of 50 cases with NSCLC,the gene mutation rate of EGFR was 38.0%(19/50),which was closely correlated with gender,histopathological type,smoking(P＜0.05),which had no correlations with age,differentiated degree,postion,nation,clinical stages(P＞0.05);the mutation rate in metastatic focus was 22.0% (11/50),which had a statistically significant difference compared with gene mutation rate of EGFR in primary focus(P＜0.05),while it had no correlations with other clinicopathologic features(P＞0.05).Conclusion The gene mutation of EGFR was mainly concentrated on female,pulmonary adenocarcinoma,non-smoking patients,and shows different mutation in primary focus and metastatic focus of NSCLC,put up the heterogeneity of tumor,which affects the curative effect.

Epidermal growth factor receptor;Non-small cell lung cancer;Primary focus;Metastatic focus;Real-time polymerase chain reaction

R734.2

A

1673-7210（2015）07（c）-0021-05

2015-03-19本文编辑：张瑜杰）

▲通讯作者