新型7-O-(芳基氨基甲酸酯)-布雷菲德菌素A的合成及其抗肿瘤活性*

吴植献，王亚军，陈 玮，薛 锋，万南微，郑裕国

(浙江工业大学生物工程研究所，浙江杭州 310014)

布雷菲德菌素A(3，Chart 1)是一种具有多重生物活性，由真菌发酵产生的13元环的大环内酯类抗生素［1］。3通过与高尔基体关联的蛋白转运因子结合，阻碍蛋白质向高尔基体转运，从而表现出抗真菌、抗病毒、抗有丝分裂活性［2］，而随着蛋白在内质网上的积累会造成内质网渗透压的升高，最终导致细胞的程序性死亡，使其具有了对多种癌细胞具有抑制活性［3－4］。

Scheme 1

Chart 1

美国肿瘤研究院将3作为抗肿瘤药物重点研究，视为新型抗癌候选药物［5］。但由于3自身的药代动力学性质(水溶性差、血浆半衰期短、细胞选择性差等)不理想，阻碍了其作为抗肿瘤治疗药物的临床研究［6］。研究发现，3的4-羟基是其活性的关键位点［7－9］。

本课题组曾对3的发酵和分离纯化进行过研究［10－11］。本文将芳胺(1a ～1m)或环己胺(1n)与三光气反应制得芳基异氰酸酯(2a～2n);2a～2n分别对3的7-羟基进行结构修饰，合成了14个新型布雷菲德菌素A氨基甲酸酯类衍生物——7-O-(芳基氨基甲酸酯)-布雷菲德菌素A(4a～4n)，其结构经1H NMR，13C NMR和 ESIHR-MS表征。并对其抗肿瘤活性进行了研究。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AvanceⅢ500 MHz型和Avance 126 MHz型核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标);Esquire 6000型电感耦合等离子体质谱仪。

3 按文献方法［10－11］制备(含量 99.5%);其余所用试剂均为分析纯，其中甲苯经干燥重蒸后使用。

1.2 合成

(1)2a～2n的合成(以2a为例)

在反应瓶中加入三光气60 mg(0.2 mmol)和无水甲苯20 mL，搅拌使其溶解;冰浴冷却，于1 h内滴加混合液［苯胺(1a)46 mg(0.5 mmol)+催化剂三乙胺40 μL+无水甲苯50 mL］，滴毕，于室温反应30 min;回流(80℃)反应3 h至反应液澄清［12］。减压蒸除溶剂得黄色固体2a 58 mg(直接进行下步反应)。

用类似的方法合成2b～2n。

(2)4a～4n的合成(以4a为例)

在反应瓶中依次加入3 110 mg(0.4 mmol)，无水甲苯30 mL和吡啶200 μL，升温至回流(90℃)使其溶解;将溶液直接倒入上述2a的浓缩圆底瓶中，回流反应6 h［TLC跟踪:展开剂:A=V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶5］。减压旋干甲苯，残余物用二氯甲烷50 mL溶解，用饱和氯化钠溶液(3×10 mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，减压旋干溶剂后用少量甲醇溶解，经自制硅胶板(展开剂:A=1∶2)分离，取目标产物条带，将硅胶条带刮下，粉碎，经硅胶柱层析(洗脱剂:A=1∶2)纯化得淡黄色粉末4a。

用类似的方法合成淡黄色粉末4b～4n。

7-O-(苯基氨基甲酸酯)-布雷菲德菌素 A(4a):产率 31.7%;1H NMR δ:7.41 ～7.19(m，6H)，5.92(d，J=15.6 Hz，1H)，5.82 ～ 5.57(m，1H)，5.12(dd，J=8.7 Hz，4.5 Hz，1H)，4.85(dd，J=10.4 Hz，5.7 Hz，1H)，4.11(d，J=8.7 Hz，1H)，2.49 ～2.05(m，4H)，2.03(d，J=27.9 Hz，1H)，1.93 ～1.78(m，3H)，1.77 ～1.69(m，1H)，1.67 ～ 1.57(m，1H)，1.69 ～1.58(m，1H)，1.57 ～ 1.45(m，1H)，1.26(t，J=6.2 Hz，3H)，0.92(dd，J=19.6 Hz，12.7 Hz，1H);13C NMR δ:166.28，154.88，151.61，136.04，131.50，130.90，129.46，129.05，121.68，121.62，117.69，75.81，75.69，71.82，52.22，43.98，43.94，40.23，38.74，34.98，31.83，26.67，20.84;ESI-HR-MS m/z:Calcd for C23H29NO5Na{［M+Na］+}422.2，found 422.1。

7-O-(苄基氨基甲酸酯)-布雷菲德菌素 A(4b):产率 26.4%;1H NMR δ:7.41 ～7.19(m，6H)，5.92(d，J=15.6 Hz，1H)，5.82 ～ 5.57(m，1H)，5.12(dd，J=8.7 Hz，4.5 Hz，1H)，4.85(dd，J=10.4 Hz，5.7 Hz，1H)，4.48 ～4.19(m，2H)，4.11(d，J=8.7 Hz，1H)，2.49 ～2.05(m，4H)，2.03(d，J=27.9 Hz，1H)，1.93 ～1.78(m，3H)，1.77 ～1.69(m，1H)，1.67 ～1.57(m，1H)，1.69 ～1.58(m，1H)，1.57 ～1.45(m，1H)，1.26(t，J=6.2 Hz，3H)，0.92(dd，J=19.6 Hz，12.7 Hz，1H);13C NMR δ:166.28，156.23，151.68，138.50，136.14，130.70，130.56，128.66，128.63，127.53，127.47，117.60，75.80，75.73，71.72，52.14，45.01，43.91，40.26，38.71，34.15，31.80，26.65，20.83;ESI-HR-MS m/z:Calcd for C24H31NO5Na{［M+Na］+}436.2，found 436.1。

7-O-(邻甲基苯氨基甲酸酯)-布雷菲德菌素A(4c):产率32.0%;1H NMR δ:7.54 ～7.01(m，5H)，5.91(s，1H)，5.23(d，J=64.1 Hz，2H)，4.85(s，1H)，4.41(s，1H)，4.09(s，1H)，2.31(t，J=33.2 Hz，6H)，1.86(s，3H)，1.75 ～1.62(m，3H)，1.45(d，J=80.0 Hz，2H)，1.28 ～1.08(m，3H)，0.93(s，1H);13C NMR δ:166.33，156.67，151.84，136.00，135.34，131.54，131.01，130.74，130.37，127.05，126.75，117.53，76.18，75.59，71.72，52.01，43.86，40.17，38.60，34.04，31.77，26.62，20.80，17.67;ESI-HR-MS m/z:Calcd for C24H31NO5Na{［M+Na］+}436.2，found 436.1。

7-O-(对甲苯基氨基甲酸酯)-布雷菲德菌素A(4d):产率 31.8%;1H NMR δ:8.02 ～6.50(m，5H)，5.80(m，1H)，5.62 ～4.98(m，2H)，4.87(s，1H)，4.87(s，1H)，4.40(s，1H)，4.40(s，1H)，3.04 ～2.11(m，6H)，2.01(s，1H)，1.78(dd，J=78.0 Hz，16.3 Hz，4H)，1.50(d，J=39.1 Hz，2H)，1.25(t，J=20.2 Hz，3H)，0.93(s，1H);13C NMR δ:166.30，155.05，151.72，136.08，135.11，130.80，129.99，129.56，129.52，123.38，122.00，117.62，75.76，75.64，71.79，52.20，43.93，40.21，38.74，34.09，31.82，26.68，20.85，20.74;ESI-HR-MS m/z:Calcd for C24H31NO5Na{［M+Na］+}436.2，found 436.1。

7-O-(对氯苯基氨基甲酸酯)-布雷菲德菌素A(4e):产率 30.5%;1H NMR δ:7.51 ～ 7.44(m，3H)，7.34(t，J=14.0 Hz，3H)，5.72(s，2H)，5.33 ～5.21(m，2H)，5.03(s，1H)，4.72(s，1H)，4.03(s，1H)，2.27 ～2.07(m，4H)，1.77 ～1.61(m，4H)，1.50(d，J=8.3 Hz，3H)，1.20(t，J=10.2 Hz，3H)，0.76(s，1H);13C NMR(DMSO)δ:196.96，165.63，154.11，153.12，138.26，136.43，130.59，130.03，129.11，128.59，123.44，119.60，116.94，75.49，73.96，70.88，51.90，42.69，40.02，38.29，33.45，31.42，26.53，20.70;ESI-HR-MS m/z:Calcd for C23H28NO5ClNa{［M+Na］+}456.2，found 456.1。

7-O-(邻氯苯基氨基甲酸酯)-布雷菲德菌素A(4f):产率 28.2%;1H NMR δ:7.33(t，J=26.3 Hz，4H)，7.11(s，1H)，7.00(s，1H)，5.94(s，J=15.7 Hz，1.8 Hz，1H)，5.74(s，J=15.0 Hz，10.2 Hz，4.6 Hz，1H)，5.33 ～ 5.22(m，1H)，5.22 ～5.12(m，1H)，4.92 ～4.79(m，1H)，4.14(d，J=9.0 Hz，1H)，2.37 ～2.27(m，3H)，1.86(d，J=6.9 Hz，3H)，1.72(d，J=6.6 Hz，2H)，1.52(d，J=16.4 Hz，2H)，1.27(t，3H)，0.96(s，1H);13C NMR δ:166.17，152.79，151.45，135.89，134.67，131.01，129.06，127.72，125.80，125.37，123.73，117.75，76.54，75.76，71.73，52.04，43.93，41.97，40.18，38.62，34.11，31.79，27.00，26.63，20.83;ESI-HR-MS m/z:Calcd for C23H28NO5ClNa{［M+Na］+}456.2，found 456.1。

7-O-(2，4-二氯苯胺氨基甲酸酯)-布雷菲德菌素 A(4g):产率 28.9%;1H NMR δ:7.33(t，J=26.3 Hz，4H)，7.11(s，1H)，7.00(s，1H)，5.94(d，J=15.7 Hz，1.8 Hz，1H)，5.74(d，J=15.0 Hz，10.2 Hz，4.6 Hz，1H)，5.33 ～5.22(m，1H)，5.22 ～5.12(m，1H)，4.92 ～4.79(m，1H)，4.14(d，J=9.0 Hz，1H)，2.37 ～2.27(m，3H)，1.86(d，J=6.9 Hz，3H)，1.72(d，J=6.6 Hz，2H)，1.52(d，J=16.4 Hz，2H)，1.27(t，J=5.3 Hz，3H)，0.96(s，1H);13C NMR δ:166.17，165.67，152.66，151.38，147.11，136.22，135.82，133.52，131.13，128.76，127.90，117.83，75.77，71.77，52.04，43.95，40.19，38.65，34.15，31.80，26.62，20.83;ESI-HR-MS m/z:Calcd for C23H27NO5Cl2Na{［M+Na］+}490.1，found 490.4。

7-O-(对氟苯基氨基甲酸酯)-布雷菲德菌素A(4h):产率 30.5%;1H NMR(DMSO-d6)δ:7.53(s，1H)，7.47(s，2H)，7.36(d，J=15.6 Hz，1H)，7.27(s，1H)，7.12(d，J=8.8 Hz，2H)，5.74(d，J=15.4 Hz，2H)，5.25(d，J=11.0 Hz，3H)，5.02(s，1H)，4.72(s，2H)，4.09(d，J=43.8 Hz，2H)，2.49(d，J=15.7 Hz，3H)，2.23(s，1H)，2.07(s，1H)，1.94(s，1H)，1.80(d，J=12.4 Hz，4H)，1.64(s，1H)，1.50(d，J=11.2 Hz，2H)，1.21(t，J=10.7 Hz，3H)，0.75(s，1H);13C NMR δ:166.10，157.06，154.58，153.75，136.92，131.00，130.48，125.38，125.31，116.93，115.80，115.62，75.81，74.45，71.36，52.38，43.16，41.47，38.77，33.92，31.89，26.87，21.16;ESI-HR-MS m/z:Calcd for C23H28NO5FNa{［M+Na］+}440.2，found 440.1。

7-O-(2，4-二氟苯基氨基甲酸酯)-布雷菲德菌素 A(4i):产率 30.3%;1H NMR δ:7.32(d，J=15.6 Hz，3H)，7.27(s，1H)，7.12(d，J=8.8 Hz，2H)，5.74(d，J=15.4 Hz，2H)，5.25(d，J=11.0 Hz，3H)，5.02(s，1H)，4.72(s，2H)，4.09(d，J=43.8 Hz，2H)，2.49(d，J=15.7 Hz，3H)，2.23(s，1H)，2.07(s，1H)，1.94(s，1H)，1.80(d，J=12.4 Hz，4H)，1.64(s，1H)，1.50(d，J=11.2 Hz，2H)，1.21(t，J=10.7 Hz，3H)，0.75(s，1H);13C NMR δ:166.26，158.47，154.29，151.54，136.06，130.90，130.88，120.59，117.72，114.59，114.29，100.53，75.83，71.80，55.53，52.24，43.95，40.23，38.75，34.14，31.84，26.65，20.85;ESI-HR-MS m/z:Calcd for C23H28NO5F2Na{［M+Na］+}458.2，found 458.1。

7-O-(对二氟氧甲基苯基氨基甲酸酯)-布雷菲德菌素 A(4j):产率 26.3%;1H NMR δ:7.41(m，2H)，7.28(t，3H)，7.18(t，1H)，7.02(d，J=4.6 Hz，2H)，5.92 ～ 5.98(d，J=15.7 Hz，1H)，5.72(s，2H)，5.33 ～5.21(m，2H)，5.03(s，1H)，4.72(s，1H)，4.03(s，1H)，2.27 ～2.07(m，4H)，1.77 ～1.61(m，4H)，1.50(d，J=8.3 Hz，3H)，1.20(t，J=10.2 Hz，3H)，0.76(s，1H);13C NMR δ:169.43，166.55，153.30，151.97，136.04，130.87，124.45，123.11，120.85，120.57，117.56，116.05，113.96，75.82，72.05，52.28，43.94，40.20，38.83，34.06，31.86，26.69，20.82;ESI-HR-MS m/z:Calcd for C23H29NO6F2Na{［M+Na］+}488.2，found 488.1。

7-O-(邻三氟甲基苯氨基甲酸酯)-布雷菲德菌素 A(4k):产率 28.7%;1H NMR δ:7.55(s，2H)，7.38(s，1H)，7.28(s，1H)，7.19(s，1H)，6.88(s，1H)，5.92 ～ 5.98(d，J=15.7 Hz，1H)，5.72(s，2H)，5.33 ～5.21(m，5H)，5.03(s，1H)，4.72(s，1H)，4.03(s，1H)，2.27 ～2.07(m，4H)，1.77 ～ 1.61(m，4H)，1.50(d，J=8.3 Hz，3H)，1.20(t，J=10.2 Hz，3H)，0.76(s，1H);13C NMR δ:166.26，166.19，153.06，151.43，135.81，135.61，132.93，131.07，129.17，126.10，126.05，123.61，117.80，75.79，71.77，52.02，43.95，40.19，38.54，34.14，31.81，26.61，20.83;ESI-HR-MS m/z:Calcd for C23H28NO5F3Na{［M+Na］+}490.2，found 490.5。

7-O-(对氧甲基苯氨基甲酸酯)-布雷菲德菌素 A(4l):产率29.7%;1H NMR δ:7.37(d，J=15.7 Hz，1H)，7.28(s，1H)，6.87(d，J=5.2 Hz，1H)，5.92 ～ 5.98(d，J=15.7 Hz，1H)，5.72(s，2H)，5.33 ～ 5.21(m，2H)，5.03(s，1H)，4.72(s，1H)，4.03(s，1H)，2.27 ～2.07(m，4H)，1.77 ～1.61(m，4H)，1.50(d，J=8.3 Hz，3H)，1.20(t，J=10.2 Hz，3H)，0.76(s，1H);13C NMR δ:166.19，152.99，151.41，135.89，135.18，131.44，131.10，131.07，130.76，117.80，111.33，111.16，75.75，71.79，52.16，44.16，43.94，40.18，38.70，34.15，31.83，26.64，20.84;ESI-HR-MS m/z:Calcd for C24H31NO5Na{［M+Na］+}451.2，found 451.1。

7-O-(萘基氨基甲酸酯)-布雷菲德菌素 A(4m):产率 35.6%;1H NMR δ:7.87(d，J=7.1 Hz，2H)，7.68(d，J=8.2 Hz，1H)，7.62 ～7.43(m，3H)，7.28(s，1H)，7.08(d，J=4.3 Hz，1H)，5.92(d，J=15.6 Hz，1H)，5.82 ～5.57(m，1H)，5.12(dd，J=8.7 Hz，4.5 Hz，1H)，4.85(dd，J=10.4 Hz，5.7 Hz，1H)，4.11(d，J=8.7 Hz，1H)，2.49 ～ 2.05(m，4H)，2.03(d，J=27.9 Hz，1H)，1.93 ～ 1.78(m，3H)，1.77 ～ 1.69(m，1H)，1.67 ～ 1.60(m，1H)，1.57 ～1.45(m，1H)，1.26(t，J=6.2 Hz，3H)，0.92(s，1H);13C NMR δ:166.28，151.67，149.73，136.30，136.01，134.08，132.54，130.74，129.39，128.68，126.26，126.03，125.75，120.65，118.16，117.62，76.49，75.68，71.87，52.12，43.85，41.97，38.71，34.09，31.79，26.83，20.72;ESI-HR-MS m/z:Calcd for C27H31NO5FNa{［M+Na］+}472.2，found 472.1。

7-O-(环己烷氨基甲酸酯)-布雷菲德菌素A(4n):产率 18.1%;1H NMR δ:7.41 ～7.19(m，1H)，5.92(d，J=15.6 Hz，1H)，5.82 ～ 5.57(m，1H)，5.12(d，J=8.7 Hz，4.5 Hz，1H)，4.85(d，J=10.4 Hz，5.7 Hz，1H)，4.11(d，J=8.7 Hz，1H)，3.50(m，1H)，2.49 ～ 2.05(m，4H)，2.03(d，J=27.9 Hz，1H)，1.93 ～1.78(m，3H)，1.77 ～ 1.69(m，1H)，1.67 ～1.57(m，1H)，1.69 ～ 1.58(m，3H)，1.57 ～1.45(m，4H)，1.26(t，J=6.2 Hz，3H)，0.92(d，J=19.6 Hz，12.7 Hz，1H);13C NMR δ:166.34，156.75，151.63，130.73，130.61，117.65，75.83，75.19，71.73，49.18，43.96，38.74，34.13，33.96，33.46，31.82，26.68，25.63，25.50，25.47，24.95，24.80，20.86;ESI-HR-MS m/z:Calcd for C23H35NO5FNa{［M+Na］+}433.2，found 433.1。

1.3 抗肿瘤活性测定

将人食管癌细胞TE-1按5.0×103细胞/孔均匀种植于细胞培养96孔板中，置于5%二氧化碳培养箱，于37℃培养24 h。以DMSO为溶剂，配制不同c(4)溶液;向各孔中添加c(4)(每个重复处理3次，取平均值)，于37℃培养48 h。每孔中加入10 μL WST-1细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒，于37℃孵育2 h，利用酶标仪测定每孔450 nm处的吸光度(A)，以空白细胞培养液作为对照组，计算c(4)处理后人食管癌细胞TE-1存活率［存活率/%=(A药液－A培养液)/(A对照－A培养液)×100%］。

2 结果与讨论

2.1 合成

本文首次采用异氰酸酯对3的7-羟基进行结构修饰，合成了14个新型的布雷菲德菌素A氨基甲酸酯类衍生物。该方法具有催化剂便宜易得，反应条件较温和等优点。

2.2 抗肿瘤活性

4g，4i～4l对食管癌TE-1细胞株的肿瘤抑制活性见表1。由表1可见，在各个用药量时，他们中的大部份化合物均失去了对食管癌TE-1细胞株的抗肿瘤活性。

表1 4g，4i～4l对TE-1的抑制活性Table 1 Inhibitions activities of 4g，4i～4l against TE-1 cell

为了从靶位蛋白与小分子作用关系来解释抗肿瘤活性实验结果，我们选取4i，4j和4l与蛋白进行分子对接研究。利用DS2.5软件中的LiDOCK模块进行了分子对接，结果见图1。图1结果表明，3被带苯环的大基团修饰以后，分子空间体积变大。分子4只能结合在活性区域的外表面，而不能进入3所结合的活性区域，与特定的ASP67和TRP78两个氨基酸作用，导致4与靶位蛋白的相互作用力减弱，肿瘤抑制活性降低。这就是4丧失抑制食管癌细胞株TE-1活性的原因。

图1 4与靶点ARF1-GDP-GEF复合体的模拟对接图Figure 1 Docking for 4 in the ARF1-GDP-GEF interface

3 结论

首次采用异氰酸酯对布雷菲德菌素A的7-羟基进行结构修饰，合成了14个新型的布雷菲德菌素A氨基甲酸酯类衍生物。布雷菲德菌素A氨基甲酸酯类衍生物的合成及其生物活性评价，为布雷菲德菌素A衍生化研究提供借鉴。

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