计算机辅助设计的新型胰蛋白酶抑制剂的合成及其抑制活性

奚宇兰，任建东，田伏洲，何 菱

(1.四川大学华西药学院，四川成都 610041;2.成都军区总医院，四川成都 610083)

Scheme 1

急性胰腺炎是临床常见急腹症之一，死亡率高达10% ～50%［1］。针对急性胰腺炎发病机制［2－3］，学者们将研究重点放在胰蛋白酶抑制剂上，确定其与胰蛋白酶的确切结合位点［4－6］。结果表明，带羟基的小分子抑制剂与胰蛋白酶结合后，羟基与蛋白质氨基酸残基Ser195，His57和水分子以三个以上的短氢键结合，提高了抑制剂与胰蛋白的亲和力，从而增强抑制活性［7］。但伴随的脱水作用可能会降低配体与受体的亲和力［8］，影响最终的疗效。

萘莫司他(NMT)是常用的胰蛋白酶抑制剂，抑制活性高，作用强而持久，是治疗急性胰腺炎最重要的药物之一。为进一步提高NMT的抑制活性，本文借助计算机辅助药物设计法(分子对接法autodock)，结合药物设计理论，对NMT进行优化设计和构效关系研究(Chart 1)，以期合成具有高抑制活性的胰蛋白酶抑制剂。即以6－氰基－2－萘酚为原料，经两步反应制得6－羟基－2－萘甲脒甲磺酸盐(2);2分别与芳酸(1a～1h)反应，合成了8个萘甲脒蛋白酶抑制剂(3a～3h，Scheme 1);硝基化合物(4)经还原反应合成了1个嘧啶胰蛋白酶抑制剂(3i，Scheme 1)。以邻胺基苯酚为原料，经两步反应合成了1个嘧啶胰蛋白酶抑制剂(3j，Scheme 1)。3b～3f为新化合物，其结构经1H NMR，13C NMR 和 HR－ESI－MS 表征。并研究了3a～3j对胰蛋白酶的抑制活性。

Chart 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Varian Mercury 400 MHz型核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标);Aglient－6890型质谱仪;分子模拟工作站(联想深腾1800型服务器，Autodock 4.0，Chimera，Accelrys DS Visualizer模拟软件)。

1a～1h，自制;其余所用试剂均为分析纯。

1.2 分子模拟和化合物虚拟筛选

根据已有蛋白质数据库，采用Chimera剥离配体和胰蛋白酶受体后新建单独的小分子配体数据库和大分子受体数据库。使用Autodock对接配体和相应受体，依据运算结果验证能量匹配和构象匹配后，确定1 mtu为最优大分子蛋白质受体母体。运用Autodock进行分子对接运算，详细分析配体与受体结合的活性位点和氨基酸残基特征。受体蛋白除去原始配体和水分子后，添加极性氢并加载AM1－BCC电荷。配体经分子力学优化后，添加极性氢并加载AM1－BCC电荷。用Autogrid 4.0 计算格点能量［40 Å ×40 Å × 40 Å，格点间隔 0.375 Å，中心坐标(－ 3.578，6.338，26.415)］。分子对接运算采用 Lamarckian遗传算法(对接循环参数200，其余参数为默认值)，配体和受体间的结合情况采用半经验自由能计算方法。具体运算用Autodock 4.0完成。采用分子对接算法分析现有药物与胰蛋白酶受体的结合模式，比较NMT在受体活性位点的对接运算构象(图1)以及胰蛋白酶与配体复合物的晶体结构，可验证文献报道的活性位点特征。

根据结合自由能和分子受体活性位点氨基酸残基的结合情况，选择了10个具有代表性的脒基胍基取代的芳环化合物(3a～3h)，用于下一步的合成和体外活性测试。

图1 NMT与胰蛋白酶相互作用模式Figure 1 The interactive model between NMT and trypsin

1.3 合成

(1)2的合成

冰浴冷却下，在反应瓶中加入甲醇50 mL，通入干燥 HCl气体至饱和;加入 6－氰基－2－萘酚 8.5 g(50 mmol)，搅拌下于室温反应过夜。减压浓缩蒸除甲醇和残余HCl;残余物用甲醇50 mL溶解后，于50℃通入干燥氨气，反应3 h。减压浓缩，剧烈搅拌下向残余物中加入饱和碳酸氢钠溶液，析出固体，过滤，滤饼用水洗涤，干燥得粗品;加入甲醇10 mL，冰浴冷却下滴加甲磺酸5.8 g(60 mmol)，滴毕，于室温反应0.5 h。加入乙醚，析出固体，过滤，滤饼用乙醚洗涤，无水乙醇重结晶得白色固体2。

(2)3a～3h的合成(以3a为例)

在反应瓶中加入4－(4－硝基苄氨基)苯甲酸60 mg(0.22 mmol)，2 75 mg(0.27 mmol)和无水吡啶5 mL，搅拌使其溶解;加入二环己基碳二亚胺(DCC)54 mg和 4－二甲氨基吡啶(DMAP)2.7 mg，于室温反应过夜。减压蒸除吡啶，残余物经硅胶柱层析［洗脱剂A:V(氯仿)∶V(甲醇)=20∶1］纯化得白色固体3a。

用类似的方法合成白色固体3b～3h。

3a:1H NMR δ:9.50(s，2H)，9.22(s，2H)，8.55(s，1H)，8.24(d，J=8.8 Hz，2H)，8.16(t，J=8.8 Hz，2H)，7.92 ～7.85(m，4H)，7.64 ～7.55(m，4H)，6.72(d，J=8.8 Hz，2H)，4.59(d，J=6.0 Hz，2H);13C NMR δ:166.0，164.8，155.6，153.5，151.2，148.1，146.8，136.0，132.3，131.0，129.8，129.7，128.6，128.4，125.4，124.6，124.0，123.9，119.2，115.2，112.0，45.4;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C25H20N4O4{［M+H］+}441.156 3，found 441.155 4。

3b:1H NMR δ:9.49(s，2H)，9.14(s，2H)，8.56(s，1H)，8.23 ～8.16(m，2H)，8.00(d，J=2.4 Hz，1H)，7.89 ～ 7.85(m，2H)，7.77(d，J=2.4 Hz，1H)，7.66 ～7.63(m，1H)，7.49(t，J=7.2 Hz，4H)，7.37 ～7.26(m，7H)，6.85(d，J=9.6 Hz，1H)，6.81(d，J=9.6 Hz，1H)，6.62 ～6.54(m，2H)，4.91(d，J=5.6 Hz，2H)，4.87(d，J=5.6 Hz，2H);13C NMR δ:166.0，164.6，153.4，151.0，148.1，136.4，136.3，136.0，133.5，133.1，131.2，130.0，129.8，129.0，128.8，128.4，128.3，126.9，126.8，125.7，125.0，124.8，124.6，123.8，121.1，119.3，114.8，113.4，68.5，69.3;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C36H30N2O4{［M+H］+}，555.228 4，found 555.226 0。

3c:1H NMR δ:9.32(s，4H)，8.54(s，1H)，8.16(t，J=9.2 Hz，2H)，7.92 ～7.85(m，4H)，7.57(dd，J=2.0 Hz，8.8 Hz，1H)，7.47 ～ 7.37(m，5H)，6.71(d，J=8.8 Hz，2H)，4.41(d，J=6.0 Hz，2H);13C NMR δ:165.9，164.8，156.0，153.6，151.3，138.6，136.0，132.2，131.7，131.0，129.8，129.7，129.3，128.7，125.5，124.6，124.0，119.2，114.8，111.9，45.3;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C25H20N3O2Cl{［M+H］+}430.132 2，found 430.131 7。

3d:1H NMR δ:11.37(s，1H)，9.57(s，2H)，9.31(s，2H)，8.60(s，1H)，8.33 ～ 8.16(m，7H)，8.01(s，1H)，7.91 ～7.89(m，3H)，7.67 ～7.65(m，1H)，3.90(s，2H);13C NMR δ:166.0，164.4，150.9，144.0，136.0，131.6，131.2，130.0，129.9，128.7，125.4，124.8，123.8，123.5，119.3，119.1，41.5;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C20H18N4O3{［M+H］+}363.145 7，found 363.146 5。

3e:1H NMR δ:10.6(s，1H)，8.78(s，4H)，8.58(s，1H)，8.23 ～8.14(m，4H)，8.01(d，J=2.0 Hz，1H)，7.88(d，J=9.2 Hz，3H)，7.67 ～7.64(m，1H)，2.86(t，J=7.6 Hz，2H)，2.54(t，J=7.6 Hz，2H)，1.93 ～1.88(m，2H);13C NMR δ:171.6，166.0，164.4，150.9，144.8，136.0，131.4，131.1，130.0，129.8，128.7，125.4，124.7，123.8，122.7，119.3，118.8，38.5，33.5，23.2;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C22H22N4O3{［M+H］+}391.177 0，found 391.176 9。

3f:1H NMR δ:9.85(s，1H)，9.55(s，3H)，9.30(s，2H)，8.59(s，1H)，8.24 ～ 8.19(m，2H)，7.95(s，1H)，7.90(d，J=8.8 Hz，1H)，7.59(d，J=8.8 Hz，1H)，4.46(t，J=9.6 Hz，1H)，3.00 ～ 3.02(m，2H)，1.99 ～ 1.66(m，6H);13C NMR δ:167.9，165.9，149.8，135.8，131.6，130.3，129.9，128.8，125.9，125.0，123.0，119.0，56.1，43.8，40.0，25.8，21.5;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C17H19N3O2{［M+H］+}298.155 6，found 298.156 1。

3g:1H NMR δ:9.52(s，2H)，9.30(s，2H)，8.93(s，2H)，8.60(s，1H)，8.26 ～ 8.07(m，5H)，7.91(s，1H)，7.72(s，1H);13C NMR δ:165.9，163.9，151.3，150.4，136.4，135.8，131.3，130.2，129.8，128.8，125.9，124.9，123.4，123.3，119.2;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C17H13N3O2{［M+H］+}292.108 6，found 292.109 0。

3h:1H NMR δ:9.51(s，2H)，9.33(d，J=1.6 Hz，1H)，9.17(s，2H)，8.94(dd，J=1.6 Hz，4.4 Hz，1H)，8.58(s，1H)，8.54(dt，J=2.0 Hz，8.0 Hz，1H)，8.25 ～ 8.18(m，2H)，8.07(d，J=2.0 Hz，1H)，7.90 ～7.88(m，1H)，7.74 ～7.69(m，2H);13C NMR δ:166.0，162.5，150.4，147.7，143.3，135.9，131.6，130.4，130.0，129.8，129.0，127.6，126.7，126.1，125.0，123.4，119.3;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C17H13N3O2{［M+H］+}292.108 6，found 292.108 2。

(3)4的合成

在反应瓶中加入对硝基苯甲酸100 mg(0.66 mmol)，2－氨基嘧啶60 mg(0.63 mmol)和干燥吡啶9 mL，搅拌使其溶解;加入 DCC 250 mg和DMAP 7 mg，于室温反应24 h。减压蒸除吡啶，残余物经硅胶柱层析［洗脱剂B:V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=100∶1］纯化得白色固体4。

(4)3i的合成

在反应瓶中加入4 474 mg(2 mmol)，甲醇6 mL和水6 mL，搅拌使其形成悬浮液;加入铁粉761 mg，于室温滴加数滴冰醋酸，滴毕，回流(100℃)反应1.5 h。冷却至室温，滤除过量铁粉，滤液减压浓缩，残余物经硅胶柱层析(洗脱剂:B=30 ∶1)纯化得类白色固体 3i。1H NMR δ:10.46(s，1H)，8.68 ～8.67(m，1H)，7.72(d，J=8.0 Hz，2H)，7.19 ～7.17(m，1H)，8.56(d，J=8.0 Hz，2H)，5.85(s，2H);13C NMR δ:165.4，158.9，158.5，153.0，130.5，120.5，116.9，112.8;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C11H10N4O{［M+H］+}215.093 3，found 215.093 9。

(5)3j的合成

冰浴下，在反应瓶中加入邻胺基苯酚140 mg(1.28 mmol)，Boc－硫脲 357 mg(1.29 mmol)和DMF(2.1ml)，搅拌使其溶解;加入三乙胺 0.42 mL，缓慢滴加氯化汞385 mg的 DMF(1 mL)溶液，滴毕，反应1h;于室温反应18 h。旋干，固体用浓盐酸/乙酸乙酯(V∶V=1∶1)0.5 mL溶解;搅拌0.5 h，用碳酸氢钠调至pH 6～7，经硅胶柱层析(洗脱剂:A=9∶1)纯化得到黄色固体3j。1H NMR δ:10.22(s，1H)，9.30(s，1H)，7.36(s，2H)，7.18 ～7.03(m，3H)，6.84(t，J=7.2 Hz，1H)，3.60(s，1H);13C NMR δ:156.7，152.8，128.7，127.8，121.9，119.6，116.8;HR－ESI－MS m/z:Calcd for C7H9N3O{［M+H］+}152.082 4，found 152.082 3。

表1 3a～3j对胰蛋白酶的抑制活性Table 1 The inhibitory activities of 3a～3j against trypsin

2 结果与讨论

2.1 分子模拟

分子模拟与实验结果产生偏差的原因主要有:(一)Autodock评价结合自由能的精确度有限制。Autodock只能将受体作为刚性体，而不能评价柔性受体与配体发生诱导契合时的能量变化;(二)准备过程中除去了水分子，Autodock的运算结果不能反映水分子在配体与受体结合过程中的作用;(三)Autodock运算时无法预测化合物的理化性质。因此，根据实验经验和药物设计理论，通过优化方案，设计并合成了3d和3e。

3d和3e对接到胰蛋白酶的活性位点，形成低能量构象。3a～3j在S1位点的结合模式都是高度保守的，配体的脒基和受体的氨基酸残基Asp189形成盐桥，并由氢键进一步稳定。3d和3e与原配体 BX5633相比，S3位点的 Asn97和Ser96氨基酸残基与配体氨基增加了氢键作用，侧链更长，与S1位点结合更加紧密。此外，3d和3e还与S2位点的His57和Ser195氨基酸残基产生了相互作用，形成新增氢键。以上因素均可能是3d和3e活性提高的原因。

2.2 抑制活性

为验证分子模拟设计结果，以NMT为对照组，考察了3a～3j对胰蛋白酶的抑制活性，结果见表1。

由表 1 可见，6－甲脒基－2－萘酚 4－(4－氨基丁酰胺)苯甲酸酯(3e)对胰蛋白酶的抑制活性最好，其IC50为0.352 μg·mL－1，优于 NMT(IC500.451 μg·mL－1)。3d抑制活性也较好，值得进一步对其活性和副作用进行探索。

3 结论

通过计算机辅助设计，合成了10个胰蛋白酶抑制剂(3a～3j)，其中3b～3f为新化合物。体外活性测试表明:6－甲脒基－2－萘酚 4－(4－氨基丁酰胺)苯甲酸酯(3e)对胰蛋白酶有较好的抑制活性，其 IC50为 0.352 μg·mL－1，优于奈莫司他(IC500.451 μg·mL－1)。

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