高压热水-酶法分段提取香菇多糖的研究

王文文，谭才邓，吴亚丽，刘嘉俊，汤敬谦，邓毛程

（1.广东轻工职业技术学院，广东 广州 510300；2.广东高校特色调味品工程技术开发中心，广东 广州 510300；3.暨南大学 图书馆，广东 广州 510632）

0 引言

香菇是世界第二大食用菌，也是我国特产之一，在民间素有“山珍”之称，是高蛋白、低脂肪的营养保健食品.香菇中的香菇多糖是典型的T 细胞激活剂，能促进人体内细胞毒T 淋巴细胞的产生，提高CTL 的杀伤活力，增强人体免疫功能[1].香菇多糖对多种肿瘤具有显著抑制作用，对化学致癌、病毒致癌也有抑制作用[2-3].此外，香菇多糖还具有降血脂、抗氧化、降血糖等多种功能[4-6].随着生活水平的提高，人们的保健意识在逐渐增强，将功能性多糖作为保健品来进行开发，也越来越受到食品行业的重视[7].

目前，多糖的提取方法主要有热水浸提法、超声波提取法、稀酸稀碱浸提法、微波提取法、酶解法等几种方法[8-11].香菇中含有大量的纤维素、果胶、蛋白质等非多糖类大分子物质，形成致密的结构，阻碍了多糖在提取过程中的释放.因此，人们利用纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶等复合酶对香菇进行处理，以破坏非多糖类物质，使香菇多糖更好地释放出来[12].不同的酶作用条件不一样，不同酶的组合对多糖的提取率亦不同，作者首次综合运用高压热水、纤维素酶、果胶酶及菠萝蛋白酶三酶分段法提取香菇多糖，使各种酶活力得到充分发挥，以最大程度提高香菇多糖提取率和提取质量，从而为多糖的综合应用提供基础.

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

香菇：购自西亚兴安超市.

纤维素酶（10 000 U/g）、菠萝蛋白酶（50 万U/g）、果胶酶（40 U/mg）：南宁庞博生物工程公司.

DNS 试剂、无水乙醇、无水葡萄糖、氢氧化钠、浓盐酸、浓硫酸、苯酚等均为分析纯.

1.2 主要仪器和设备[13]

DMF-10A 型摇摆式高速中药粉碎机：广州市旭郎机械设备有限公司；DK-S26 型电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；S22PC 型可见光分光光度计：上海凌光技术有限公司；台式低速离心机（中佳-SC-3614）：安徽中科中佳科学仪器有限公司；电子分析天平（BSA-224S-CW）：北京赛多利斯天平有限公司；雷磁酸度计（PHS-3C）：上海雷磁仪器厂.

1.3 试验方法

1.3.1 样品的制备将香菇子实体切碎片，旋风式微型高速样品粉碎机粉碎，过100 目筛，得香菇粉，备用.

1.3.2 香菇多糖的高压热水浸提

准确称取10.000 g 香菇干粉，加入200 mL 水于115 ℃下提取80 min，提取液冷却至室温，即为香菇多糖浸提液.在上述粗提液中，加入无水乙醇600 mL，使溶液乙醇浓度为75%左右，静置30 min，6 000 r/min 离心20 min，收集沉淀；再用无水乙醇重悬沉淀，6 000 r/min 离心20 min，即得粗多糖样品.

1.3.3 酶法提取香菇多糖

准确称取5.000 g 香菇干粉，放入400 mL 的烧杯中，烧杯中加入100 mL 水，置于灭菌锅中高压加热浸提，提取条件为115 ℃、80 min.提取结束后，分别从酶浓度、pH、温度、时间4 个方面研究纤维素酶、果胶酶、菠萝蛋白酶的最佳作用条件，再设计正交试验研究最大影响因素，确定最佳工艺条件.

1.3.4 高压热水-酶法分段提取香菇多糖

首先用高压热水对香菇干粉进行浸提，冷却至室温后，在上述优化的每种酶的最佳条件下依次用纤维酶、果胶酶、菠萝蛋白酶对香菇浸提液进行处理，提取香菇多糖，计算多糖得率.以单独采用高压热水浸提法的结果作为对照.

1.3.5 正交试验设计

以纤维素酶、果胶酶、菠萝蛋白酶单因素试验结果为基础，选出温度、pH、酶浓度、时间4 个因素，设计L9（34）正交试验，并进行验证试验，以香菇多糖的提取率为目标测定值，通过极差分析，确定各种酶的最大影响因素及最佳提取工艺组合.

1.3.6 多糖提取率的测定

硫酸-苯酚法测定总糖含量，测定的标准曲线方程为：

式中：Y 为吸光值；X 为葡萄糖的含量，μg/mL；r=0.996 2.

DNS 法测定还原糖含量，测定的标准曲线方程为：

式中：Y 为吸光值；X 为葡萄糖的含量，μg/mL；r=0.997 9.

多糖含量=总糖含量-还原糖含量.

粗多糖提取率=多糖含量/子实体干质量×100%.

2 结果与分析

2.1 纤维素酶、果胶酶、菠萝蛋白酶提取香菇多糖单因素试验

2.1.1 纤维素酶、果胶酶、菠萝蛋白酶浓度对香菇多糖提取率的影响（图1）

由图1 可知，在一定范围内，随着酶浓度的增加，香菇多糖的提取率逐渐增加，而超过一定酶浓度，香菇多糖的提取率反而下降.推测是由于酶浓度过高出现反馈抑制或者酶影响了多糖的结构，而导致多糖提取率下降.因此，选择纤维素酶、果胶酶、菠萝蛋白酶的合适浓度分别为2%、1.0%、1.5%.

图1 酶浓度对香菇多糖提取率的影响Fig.1 Effect of enzyme concentration on the extraction rate of lentinan

2.1.2 pH 对纤维素酶、果胶酶、菠萝蛋白酶提取香菇多糖的影响

不同风门开度下的横向配风不均匀系数模拟结果如图11所示。增加风室进口风门开度，减小尾部风门开度可以很大程度降低炉排横向配风不均匀系数。通过对比各种工况可以得出：此链条炉排在布置挡板以后最佳风门开度(从风室进口到尾部)依次为100%、70%、50%、50%、50%，其配风不均匀系数为7%，与风门全开时相比降低了69.5%。

pH 对酶提取香菇多糖的影响见图2.pH 过高或过低都会破坏酶的结构，进而影响香菇多糖提取率.由图2 可知，3 种酶的最适pH 分别为纤维素酶5.5、果胶酶5、菠萝蛋白酶4.

图2 pH 对酶提取香菇多糖的影响Fig.2 Effect of pH on the enzyme extraction rate of lentinan

2.1.3 温度对纤维素酶、果胶酶、菠萝蛋白酶提取香菇多糖的影响

温度对酶提取香菇多糖的影响见图3.由图3可知，3 种酶趋势一致，在一定温度范围内，随着温度升高，由于酶活力提高，提取率也逐渐增加，但超过酶的最适温度，提取率反而下降.纤维素酶的合适温度为40 ℃，果胶酶的合适温度为40 ℃，而菠萝蛋白酶的合适温度为55 ℃.

图3 温度对酶提取香菇多糖的影响Fig.3 Effect of temperature on the enzyme extraction rate of lentinan

2.1.4 时间对纤维素酶、果胶酶、菠萝蛋白酶提取香菇多糖的影响

时间对酶提取香菇多糖提取率的影响见图4，适当延长时间可增加提取率，但时间过长，酶活力下降，提取率不再增加，时间过短，酶活力没得到充分发挥，香菇多糖的提取率也不高.由图4 可知，纤维素酶的合适提取时间为0.5 h，果胶酶为2 h，菠萝蛋白酶为2 h.

图4 时间对酶提取香菇多糖的影响Fig.4 Effect of time on the enzyme extraction rate of lentinan

2.2 纤维素酶、果胶酶、菠萝蛋白酶正交试验研究

2.2.1 纤维素酶提取香菇多糖工艺优化

纤维素酶的正交试验因素与水平见表1.正交试验结果分析见表2，方差分析见表3.

表1 纤维素酶的正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment of cellulase

表2 纤维素酶正交试验结果分析Table 2 Analysis of orthogonal experiment of cellulase

表3 纤维素酶正交试验方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment of cellulase

2.2.2 果胶酶提取香菇多糖工艺优化

果胶酶的正交试验因素与水平见表4.正交试验结果分析见表5，方差分析见表6.

由表5 和表6 可以看出，影响因素依次为A＞B＞D＞C，即A 在0.1 水平下显著.由此确定最佳提取工艺为A2B3C2D2，而正交表格中并未出现此组合，因此进行验证试验.在A2B3C2D2条件下香菇多糖的提取率为3.19%，低于正交试验中的3.39%，因此确定最佳组合为A2B3C1D2，即在温度40 ℃、pH 4.5、酶浓度1.0%、时间1.5 h 的条件下，香菇多糖的提取率最高，为3.39%.

表4 果胶酶的正交试验因素与水平Table 4 Factors and levels of orthogonal experiment of pectinase

表5 果胶酶正交试验结果分析Table 5 Analysis of orthogonal experiment of pectinase

表6 果胶酶正交试验方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experiment of pectinase

2.2.3 菠萝蛋白酶提取香菇多糖工艺优化

菠萝蛋白酶的正交试验因素与水平见表7.正交试验结果分析见表8，方差分析见表9.

表7 菠萝蛋白酶的正交试验因素与水平Table 7 Factors and levels of orthogonal experiment of bromelain

由表8 和表9 可以看出，影响因素依次为C＞D＞B＞A，即C 在0.1 水平下显著.由此确定最佳提取工艺为A3B1C1D3，而正交表格中并未出现此组合，因此进行验证试验.在A3B1C1D3条件下香菇多糖的提取率为2.65%，高于正交试验中的2.59%，因此确定最佳组合为A3B1C1D3，即在温度60 ℃、pH 3.5、酶浓度1.0%、时间3.5 h 的条件下，香菇多糖的提取率最高，为2.65%.

表8 菠萝蛋白酶正交试验结果分析Table 8 Analysis of orthogonal experiment of bromelain

表9 菠萝蛋白酶正交试验方差分析Table 9 Variance analysis of orthogonal experiment of bromelain

2.2 不同方案提取香菇粗多糖提取率对比分析

为获得较好的香菇多糖提取率，设计了5 种提取方案，其中以高压热水提取作为参照.由图5 可知，在5 种方案中，高压热水-酶分段提起香菇多糖提取率最高，其次为高压热水-纤维素酶提取法.

图5 香菇多糖不同提取方案提取率对比Fig.5 The extraction rate compatison for different extraction method of lentinan

3 结论

本研究的主要目的是对香菇多糖提取工艺进行改进，以提高多糖提取率和产品质量.其改进主要表现在纤维素酶、果胶酶与菠萝蛋白酶酶解提取与高压热水浸提综合运用，以增加提取率和提取纯度.选用料水比为1∶20，先进行单因素试验，再进行正交试验，研究最佳提取工艺高压热水协同纤维素酶最佳提取工艺为温度40 ℃、pH 5.5、酶浓度2.0%、时间0.5 h，在此条件下，香菇多糖的提取率为4.16%.高压热水协同果胶酶最佳提取工艺为果胶酶浓度1.0%、时间1.5 h、温度40 ℃、pH 4.5，在此条件下，香菇多糖的提取率可达3.39%；高压热水协同菠萝蛋白酶提取香菇多糖最佳工艺温度60 ℃、pH 3.5、酶浓度1.0%、时间3.5 h，在此条件下，香菇多糖的提取率为2.65%、高压热水→纤维素酶→果胶酶→菠萝蛋白酶分段提取香菇多糖，香菇多糖的提取率高达5.27%，分别比高压热水、高压热水-纤维素酶、高压热水-果胶酶、高压热水-菠萝蛋白酶方案提高了101.15%、26.68%、55.46%、98.87%，在5 种提取方案中提取率最高.因此，选定高压热水-酶分段法提取香菇多糖作为今后的提取方案，进而继续对香菇多糖的综合应用开展深入研究.

［1］李丹，尚红，姜拥军，等.香菇多糖体外抗HIV 的免疫调节作用的实验研究［J］.中国免疫学杂志，2004，20（4）:253-255.

［2］王小红，余新民，沈祝苹，等.香菇多糖联合化疗对晚期结肠癌患者的临床疗效［J］.中国医药导报，2014，11（17）:65-69.

［3］游如旭，王凯平，黄璞，等.香菇多糖注射液联合化疗治疗非小细胞肺癌的疗效与安全性的Meta 分析［J］.中国药房，2014，25(32):3033-3037.

［4］王嵘，易敏，潘贤英.香菇多糖的体外抗肿瘤活性研究［J］.重庆医科大学学报，2011，36(5):572-574.

［5］邹林武，赵谋明，游丽君.香菇多糖提取工艺的优化及其抗氧化活性研究［J］.食品工业科技，2013（19）:177-182.

［6］张昕，张强，梁彦龙.香菇多糖的抗肿瘤和降糖作用机制的研究进展［J］.中国药事，2008，22（2）:149-154.

［7］王恒禹，刘玥，姜猛.多糖在食品工业中的应用现状［J］.食品科学，2013，34（21）:431-437.

［8］刘宁，李健.香菇多糖的提取工艺比较［J］.食品科学，2007，28（9）:199-202.

［9］王立波.食用菌多糖的特性及其提取工艺研究［J］.中国食品添加剂，2006（6）:68-71.

［10］万阅，齐计英，曾红，等.响应面法优化香菇多糖的超声辅助提取工艺［J］.生物技术通报，2015，31（1）:79-85.

［11］石来宝，陈静，殷霞.香菇多糖提取方法的研究［J］.药学研究，2014，33（4）:200-205.

［12］颜邦干，李卫旗，吴学谦.香菇多糖的结构分析及硫酸化研究［J］.中国食品学报，2006，6（5）:11-16.

［13］王文文，李静，邓毛程，等.纤维素酶及耐高温淀粉酶提取柑橘皮果胶的研究［J］.食品研究与开发，2014，35（5）:13-15.