以DNA 为靶标的植物油检测技术研究进展

吴兴泉，刘楷影，王贝贝，朱立娜，谷克仁

（河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001）

0 引言

植物油脂具有丰富的多不饱和脂肪酸、维生素E、甾醇等成分，这些成分在一定程度上能够很好地帮助预防冠心病、癌症、高血压、抑郁症等疾病[1]，具有良好的食用价值和药用价值，此外，植物油脂在化学分析、药品研发、化妆品合成等方面也具有很高的应用价值[2].

目前，我国植物油脂产品良莠不齐，掺伪掺假现象时有发生，植物油脂的掺假现象主要有以下两个方面，一是掺入低价位植物油，二是标识混乱.例如，在植物油脂产品的地理产地、品种来源、制作方法、转基因成分等方面进行欺骗性标识.其中掺入低价位植物油造成的掺假现象最为普遍，比如，在橄榄油中掺入榛子油、扁桃仁油、玉米油、棕榈油、葵花籽油[3]、大豆油、花生油、棉籽油等[4].尽管绝大多数的掺假情况不会对人们健康造成巨大威胁（例如低级橄榄油掺入高级橄榄油），但是个别油料作物的过敏原蛋白还是会对敏感人群造成威胁[5].掺杂现象也会给制造商带来不公平竞争，使消费者不能做出公正抉择.因此建立植物油脂的检测监控、追踪溯源技术可有效保护消费者和生产者的利益，防止掺伪掺假现象的发生.

过去的几年时间里，许多不同的分析方法用于食品溯源，主要包括3 大类，即色谱分析、光谱分析、DNA 为靶标分子的生物学分析[6-9].其中DNA 为靶标分子的分析方法具有很多优点，例如靶标分子DNA 耐保存、普遍存在，核酸序列稳定（不会随着种植环境的改变而改变）等.DNA 为靶标的植物油脂检测技术主要包括：常规聚合酶链式反应（PCR）、多重PCR、PCR-毛细管电泳-单链构象多态性检测（PCR-CE-SSCP）、PCR-高分辨率溶解曲线（PCR-HRM）[10-11]、核酸序列测定等技术，可以检测植物油脂的油料种类及同种油料的不同品种，以及是否为转基因油脂等.作者总结了以DNA 为靶标的植物油脂检测技术中涉及到的DNA提取方法、植物油脂的油料种类鉴定、转基因成分鉴定以及油料品种溯源等技术.

1 影响植物油DNA 提取及其检测效果的因素

1.1 植物油脂精炼工艺影响DNA 的含量及完整性

水溶性的DNA 在植物油中的含量很少.植物油精炼过程对DNA 的破坏导致DNA 的含量较低、完整性较差.在随后的储藏过程中，DNA 含量以及完整性会进一步遭到破坏.尽管压榨型植物油（橄榄油、花生油、芝麻油等）中的DNA 含量相对较高，但总体含量仍然很低，因此植物油脂中DNA 的高效提取成为应用以DNA 为靶标进行油脂检测技术的关键.一般增大待测植物油的用量、在DNA 提取之前增设富集过程等均可增加DNA 提取成功率[12].

1.2 植物油脂的储存时间

随着植物油储存时间的延长，空气氧化作用和核酸酶酶解作用都会破坏DNA 的含量以及完整性.为了获得良好的检测效果，待测的植物油越新鲜越好.Pafundo 等[13]依据储藏时间（1 周、3 周、6个月、9 个月、一年、二年）的不同，通过毛细管电泳形象地将植物油及相应叶片中DNA 的限制性片段长度多态性（RFLP）结果进行比较，发现储藏时间为6 个月、9 个月、一年、二年时，两者在DNA 片段数量和大小方面都有明显不同.当植物油为新获得样品时，可以获得很好的重复性.

1.3 DNA 的提取方法

现已报道的植物油脂DNA 提取方法有CTAB法、SDS 法和多种DNA 提取试剂盒法等.其中CTAB 法是传统的提取方法，不断有针对CTAB 法改进修饰方法的产生，比如：CTAB-己烷法、CTAB-己烷-氯仿法等[14].上述方法各有优缺点[15]，目前虽然已有很多DNA 的提取方法尝试用于植物油中DNA 的提取，但是或多或少会有PCR 抑制物残留，比如多糖、蛋白、酚等，因此在DNA 提取后，需要采用专门的DNA 纯化试剂盒去除PCR 抑制物.

1.4 PCR 扩增目标DNA 片段的大小

经过化学精炼过程的植物油，其含有的DNA完整性不强，后期PCR 检测时如果扩增片段较大往往会扩增失败.Costa 等[16]以大豆种属特异性基因Lectin 基因为靶标进行PCR 扩增，发现GM03/GM04 引物（118 bp）在脱胶植物油中扩增失败，而LE1/LE2 引物（103 bp）却有很好的扩增效果.采用扩增片段长度多态性（AFLP）法检测橄榄油时，储存10 d 和20 d 的样本，扩增片段大小分别低于691 bp 和415 bp，而107 bp 的扩增产物没有改变[13].如果采用SYBR qPCR 则扩增80 bp DNA 片段的效果明显好于扩增200 bp 的DNA 片段.可见，针对油脂DNA 进行分子标记分析，使用较小片段作为靶标更具优势[17].

2 以DNA 为靶标的植物油脂检测技术的应用

2.1 植物油掺假检测与鉴定

我国植物油脂市场中油脂品种很多，因营养价值不同价格差异很大，将低价位油脂掺入高价位油脂中的现象很普遍.如果能有效地检测出混合油脂中的各种组分即可实现掺假油的鉴定.不同物种具有各自不同的基因序列（即DNA 序列），这种差异在物种间稳定存在，不会因种植地域和环境条件的改变而受到影响，因此利用DNA为靶标进行植物油掺伪检测将具有很大的应用潜力.

2.1.1 鉴定方法

以DNA 为靶标的掺假油脂的鉴定主要采用PCR 法扩增各个油料作物的特定基因片段（靶基因序列），然后采用凝胶电泳、毛细管电泳等对扩增产物进行检测[18-20].由于油料作物指纹图谱与对应植物油指纹图谱的一致性以及种内保守性，在进行植物油掺假检测时，可以依据指纹图谱对应不同的油料作物以证实“掺假”情况.如果采用荧光定量PCR(qPCR)[18]技术则需要依据扩增曲线“产生与否”为标准进行判断.

2.1.2 应用实例

杨冬燕等[4]分别以2∶1、1∶1、1∶1∶1 的比例将一种或两种低价位油脂掺入一种高价位油脂中，以低价位油脂对应的油料作物种属特异性基因为靶标，通过普通PCR 及双重PCR 扩增后的电泳图定性检测掺伪现象.实验结果表明，低价位油脂掺入量的多少直接影响着检出率，以2∶1 比例掺伪的检出率最高.Spaniolas 等[19]、张海亮[20]分别依据叶绿体trnL 内含子区域、rbcL 基因序列设计通用引物，利用这些通用引物扩增常见油料作物靶基因，比如大豆、橄榄、芝麻、花生、玉米、葵花、菜籽、榛子、棉籽、鳄梨等，毛细管电泳结果显示，依据指纹图谱能够将绝大多数参试品种区分开.在区分鳄梨、芝麻与橄榄时，由于扩增片段长度相近，存在区分困难的情况，但借助SNP 位点设计引物，即可达到完全区分的效果.

2.1.3 靶基因的选择

一般采用种属特异性基因作为靶基因，需要满足两个条件：（1）该物种油料作物的所有品种均含有该基因；（2）其他物种油料作物不含有该基因或者说不存在该基因的靶序列.例如花生种属特异性基因有几丁质酶chi2.2 基因[21]、过敏原基因Arah1、Arah2、Arah3 等；大豆种属特异性基因有lectin 基因；油菜种属特异性基因有PEP 基因、HMG I/Y 基因；玉米种属特异性基因有zSSⅡb 基因、ivrl 基因等.油料作物种属特异性基因，还可以选择叶绿体基因，因为这些基因序列中部分序列在同一物种内进化速度缓慢，比较保守，但是在不同物种间进化速度较快，具有较高的种间差异性，可以用于不同物种的鉴定.

2.2 转基因油脂的检测

转基因大豆、转基因玉米、转基因油菜等油料作物因具有高油脂、抗虫、抗除草剂等特性[22]而被广泛种植，并大量用于榨油行业.为了保护消费者的知情权，有关组织颁布条例要求转基因食品必须予以声明.过去几年，很多学者基于植物油精炼后，DNA 检测不到或者检测到的含量微小，错误地认为即使植物油中含有转基因原料也不必标识.然而近几年，随着精炼植物油DNA 提取技术的成熟，DNA 提取质量有了很大提升，转基因检测也成为必不可少的部分.Costa 等[16]沿着原材料准备、植物油提取、后期精炼等过程对转基因大豆进行检测，发现大豆内标基因在所有过程样品中（包括精炼过程每个步骤）都能检测到，转基因成分在原油以及最终的精炼油中同样能检测到.

在转基因大豆油检测中，lectin 基因经常作为内源基因，抗除草剂基因EPSPS 作为外源基因.在进行外源基因检测之前，可结合转基因作物的基因图谱对调控基因（35 s 启动子基因以及T-nos 终止子基因）进行检测，此步骤被越来越多的学者认为是重要初筛步骤[23-24].

转基因玉米的种类很多，比如Bt11、MON863、MON810、Bt176、T25、GA21、TC1507 等，其中由孟山都公司研制的转基因玉米MON863，被作为主要的转基因玉米得以种植，其插入的Cry3Bb1 杀虫基因能够编码出来杀虫蛋白Cry3Bb1，该基因的检测结果可以作为植物油原料是否含有转基因玉米MON863 的判定标准.如今，植物油转基因原料检测、物种鉴定等不再是学者们研究的难点.

2.3 油脂的追踪溯源技术

在植物油油料品种溯源鉴定中研究最多的是高价位橄榄油.对于特级初榨橄榄油而言，其原料品种很大程度上决定了油品质量.由于橄榄的品种繁多[25]，橄榄油制备也从单一品种橄榄油向多品种橄榄油转变.为了对橄榄油品种进行规范，也为了使具有优良性状的品种得以延续和保护，欧盟相关组织对特定的橄榄油品种颁布了“原产地标识PDO”和“地理标识PGI”.只有具有“PDO”和“PGI”标识的橄榄油品种才能用于制备橄榄油，对不具备保护标识的橄榄油要进行品种溯源鉴定.

在橄榄油品种溯源鉴定中应用最多是DNA 标记技术，主要有：AFLP、随机扩增多态性(randomly amplified polymorphic DNAs，RAPDs)、微卫星序列（microsatellites，SSRs）、单核苷酸多态性 (singlenucleotide polymorphisms，SNPs)等.

2.3.1 AFLP 技术的应用

利用AFLP 技术不需要预先知道待扩增基因的序列，可以实现对多个基因位点同时扩增，进而可以在一个反应体系中扩增出来许多多态性条带.Busconi 等[26]对Moraiolo、Taggiasca 两个橄榄品种的叶片和橄榄油中的DNA 进行AFLP 分析，毛细管电泳检测证实，如果橄榄叶片与橄榄油来自不同品种，扩增产物的检测信号峰差别明显；如果两者为同一品种，则扩增产物的检测信号峰具有高度一致性.Pafundo 等[27]进一步利用AFLP 结合毛细管电泳对橄榄叶子以及橄榄油进行分析时，发现两者 AFLP 结果的一致性可以达到 70% .Montemurro 等[28]以10 个品种橄榄油为样品，从6个AFLP 引物组合中筛选出来多态性指数（DI 值）最大的引物组合Pst-AGG/Mse-AGG，利用该引物组合扩增产物检测结果绘制系统进化树，能够将参试的所有品种橄榄油区分开.分析发现叶子比油的扩增条带多是因为叶子中DNA 遭到破坏的程度小，大于350 bp 的片段可以扩增.

2.3.2 RAPD 技术的应用

RAPD 的特点在于操作简单、成本低、样品需求量低等.Mohammad 等[29]使用15 个RAPD 引物对13 个约旦橄榄品种进行扩增，扩增得到156 个条带，其中多态性条带的比率为55%，多态性条带中包含8 个品种特异性条带.例如引物OPOX03-250 针对橄榄品种Souri 扩增出来特异性条带，该引物可以作为鉴定该品种的特异性引物，也可以使用该引物对该品种橄榄压榨的橄榄油进行鉴定.

2.3.3 SSR 技术的应用

SSR 的特点在于具有高度的多态性.Rotondi等[30]利用13 个SSR 引物对13 个橄榄品种进行扩增，共得到72 个等位基因，其中引物DCA9 扩增的等位基因数多达9 个.也可以从SSR 引物中筛选出针对特定品种的引物，用于橄榄油品种鉴定.Pasqualone 等[31]使用橄榄Leucocarpa 品种的单一特异性SSR 引物GAPU103A 将Leucocarpa 橄榄油与参试的其他6 个单一品种的橄榄油完全区分开.其中GAPU103A 引物的PD 值较高，在Vittorio Alba等[32]实验中也得到证实，同时后者筛选出来另一个多态性引物UD043A，其单独使用同样能够将参试的7 个PDO 品种橄榄油区分开.

SSR 分析中不可避免地会遇到橄榄叶子和橄榄油DNA 扩增结果不一致的部分，Doveri 等[33]结合凝胶电泳对叶子、果肉、胚芽、油等部位的DNA扩增结果进行分析，发现额外片段存在油、胚芽中，究其原因在于胚芽基因的混入，类似的结果在Rayda 等[34-35]毛细管电泳分析中也得到证实.鉴于胚芽基因可能会混入油脂中，在利用叶子DNA 扩增结果鉴定油脂品种时，需要适当注意排除胚芽基因的干扰.

2.3.4 SNP 技术的应用

SNP 的特点在于普遍性、稳定性，能够将基因差别很小的品种区分开.Consolandi 等[36]利用多重PCR 结合LDR-UA 对含有17 个SNP 位点的基因序列进行扩增，利用扩增结果可区分8 个品种的橄榄油.

3 结论与展望

分析结果表明，以DNA 为靶标的植物油检测技术已在植物油掺假检测、转基因植物油脂检测、植物油油料品种追溯等方面取得了很好的应用效果.目前，植物油脂中的DNA 提取方法已经成熟，鉴于DNA 分子稳定性高、不易受到环境中各种不利因素影响等优势，以DNA 为靶标的植物油检测技术具有很好的应用前景.

在植物油脂掺假鉴定技术中，目前主要是以不同油料作物的种属特异性基因为靶标进行PCR扩增，然后结合凝胶电泳、毛细管电泳、荧光定量分析等手段进行定性检测.转基因原料掺入检测涉及到内源基因检测、调控基因检测、外源基因检测，其中外源基因的检测是转基因检测的核心.植物油的品种追溯主要是利用同一种油料不同品种间的特征性分子标记进行鉴定.目前应用的领域主要是橄榄油的分析，已经取得了良好的应用效果.但在其他油脂的品种追踪溯源方面尚未见到相关报道，这应该是今后植物油脂检测鉴定技术的一个发展方向.

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