不同品种葡萄干中有机酸的成分分析

徐秀娟，屈 展，何保江，杨伟平，陈芝飞，芦昶彤，孙志涛，胡 军，张文娟*

（1.中国烟草总公司郑州烟草研究院 烟草行业烟草香料基础研究重点实验室，河南 郑州 450001；2.河南中烟工业有限责任公司，河南 郑州 450016）

0 前言

葡萄科葡萄属植物葡萄的果实，又名草龙珠、蒲桃，在日光下晒干或在阴影下晾干成为葡萄干.其本质是一个自然发酵过程，葡萄的质量和体积都减小，其中可溶性固形物的含量达到了微生物难以生长利用的程度[1]，水活度也逐渐下降，这将有利于葡萄干在存储过程中保持稳定的营养结构和感官品质[2].

有机酸是葡萄及其制品的主要风味物质之一，其种类及含量与产品的稳定性和品质有较大关系[3].目前，对葡萄、葡萄皮及葡萄酒中有机酸的研究较多[4-11]，而对葡萄干的研究相对较少[12]，对不同品种葡萄干中有机酸的种类进行定性分析，并对其中含量较多的有机酸进行定量分析的研究还未见报道.葡萄干与葡萄不同，在晾晒过程中可能会由于微生物发酵产生新的有机酸，且不同品种的葡萄干，其原料及晾晒方式不同，所含有机酸的种类及含量也会有差异.因而，开展葡萄干中有机酸的成分分析，有助于了解晾晒过程中发生的变化，为葡萄干的品质控制以及天然植物的提取、应用提供理论指导.

目前，有机酸的分析检测方法主要有：气相色谱法[8，12]、高效液相色谱法[4，6，7，10]、离子色谱法[13]、薄层色谱法[14]、酸碱滴定法等.其中，酸碱滴定法主要是测定总酸含量；离子色谱法虽然灵敏度极高，但对样品前处理要求高.GC-MS 和HPLC 是常用的分析方法，由于部分有机酸的挥发性较差，因此，在采用GC-MS 方法分析时，需对样品进行一定的衍生化处理；高效液相色谱法前处理简单，适合高沸点的非挥发性有机酸的测定，操作简单，准确度高.综上所述，作者以新疆的8 种葡萄干为研究对象，考察了不同提取方法对有机酸提取率的影响，采用甲酯化方法对样品进行衍生化处理，通过GC-MS 对葡萄干中的有机酸进行定性分析，并通过HPLC 对其中含量较高的有机酸进行定量分析.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

所用原料为购买于新疆的8 种葡萄干，且经过新疆农业科学院园艺作物研究所张付春老师的鉴定.8 种葡萄干品种分别是：和田红（hotan red）、索索（black corinth）、马奶子（manaizi）、木纳格（munake）、巨峰（kyoho）、无核白鸡心（centennial seedless）、无 核 白（thomposn seedless）、无 核 紫（monukka）.

DL-酒石酸：纯度99.5%，德国Dr.Ehrenstorfer公司；苹果酸：纯度99.5%，Sigma Aldrich 公司；柠檬酸：纯度99.5%，美国New Jersey 公司；屈臣氏蒸馏水；二氯甲烷、硫酸：AR，天津科密欧化学试剂有限公司；甲醇、磷酸：HPLC，德国Merck 公司；磷酸氢二铵：AR，上海国药.

1.2 仪器与设备

Agilent Technologies 7890A-5975C GC-MS 分析仪器、Agilent Technologies-1290-Infinity 高效液相色谱仪-DAD 检测器：Agilent；JHBE-50 闪式提取器、SC-2544 离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；KH-700DE 超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；PHS-3C 型pH 计：上海精密科学仪器有限公司.

1.3 方法

1.3.1 葡萄干提取物的制备

水提：取和田红葡萄干50.00 g 剪碎，用150 mL 蒸馏水浸泡1 h，待葡萄干充分吸水膨胀后利用闪式提取器处理1 min，放入超声仪中超声提取0.5 h，再经50 ℃水浴提取0.5 h，过滤后离心分离上清液（4 000 r/min，20 min），上清液减压浓缩至干，得到和田红葡萄干浸膏28.92 g，产率57.84%.

80%醇提：取和田红葡萄干50.00 g 剪碎，用150 mL 80%乙醇浸泡1 h，待葡萄干充分膨胀后用闪式提取器处理1 min，放入超声仪中超声提取0.5 h，再经50 ℃水浴提取0.5 h，过滤后离心分离上清液（4 000 r/min，20 min），上清液减压浓缩至干，得到和田红葡萄干浸膏27.01 g，产率为54.02%.

酸提[10，15]：取和田红葡萄干50.00 g 剪碎，用150 mL 含1%（体积比）1 mol/L 的H3PO4的水溶液浸泡1 h，待葡萄干充分膨胀后用闪式提取器提取，放入超声仪中超声提取0.5 h，再经50 ℃水浴提取0.5 h，过滤后离心分离上清液（4 000 r/min，20 min），上清液减压浓缩至干，得到和田红葡萄干浸膏24.37 g，产率为48.74%.

1.3.2 试剂的配制

12.5 %的硫酸-甲醇（V/V）溶液的配制：用量筒量取350 mL 甲醇溶液，倒入1 000 mL 烧杯中，用量筒取50 mL 浓硫酸，在冰浴条件下缓慢将硫酸加入到甲醇中，在此过程中需不断搅拌，以免硫酸放热导致甲醇挥发而使甲酯化试剂失效.

0.01 mol/L 的磷酸氢二铵溶液：准确称取1.320 6 g（NH4）2HPO4试剂，用蒸馏水定容于1 L容量瓶中，使用时用1 mol/L H3PO4调节至所需的pH 值.

HPLC 用待测样品的配制：准确称取葡萄干浸膏10.00 mg，溶解后定容于10 mL 容量瓶中，放入4 ℃冰箱保存备用.使用时，用移液管取适量溶液经0.45 μm 滤膜过滤后转移到2 mL 色谱瓶中待用.

HPLC 用混合标样的配制：准确称取酒石酸10.00 mg、苹果酸1.00 mg、柠檬酸1.00 mg，用蒸馏水充分溶解，定容于50 mL 容量瓶中，作为有机酸的混合标准母液.然后依次从母液中移取4.0、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0.25 mL，分别定容于5 mL 容量瓶中.将不同浓度的混合有机酸标准液，经0.45 μm 滤膜过滤后转移到色谱瓶中备用.

1.3.3 有机酸的甲酯化

称取0.5 g 和田红葡萄干浸膏于圆底烧瓶中，加5 mL 蒸馏水溶解，然后加入12.5%的硫酸-甲醇甲酯化试剂5 mL，在70 ℃条件下水浴加热30 min.冷却后转移至分液漏斗中，加入二氯甲烷萃取3 次（5 mL×3），合并有机相，加入3 g 无水硫酸钠静置干燥0.5 h.过滤后将滤液减压浓缩至5 mL备用.

1.3.4 GC-MS 仪器条件

色谱条件：DB-5MS（60 m×250 μm，0.25 μm）弹性石英毛细管色谱柱；程序升温：初温50 ℃，以3 ℃/min 升至280 ℃，保持5 min；载气：氦气；流速：1 mL/min；进样口温度：250 ℃；进样量：10 μL；进样方式：分流；分流比：5∶1.

质谱条件：EI 源电子能量70 eV，电子倍增器电压1 600 V；质量扫描范围：33～600 AMU；参数采集模式：全扫描；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；溶剂延迟：6 min.

数据分析：根据葡萄干浸膏衍生化产物的全扫描总离子流色谱图，用NIST08.L 标准谱库进行联机检索，定性分析所含有机酸成分.

1.3.5 HPLC 仪器条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.01 mol/L 磷酸氢二铵-磷酸缓冲盐溶液（体积比为3∶97，pH 3.2）；流速：0.5 mL/min；检测波长：210 nm；柱温：30 ℃，进样量：10 μL.

2 结果与分析

2.1 GC-MS 对葡萄干中有机酸的定性分析

对于葡萄干中有机酸的提取共采用3 种方法：水提、醇提和酸提.以和田红为例，将3 种方法所得葡萄干浸膏，经硫酸-甲醇甲酯化后进样分析，其中水提物的色谱图如图1 所示，经谱库检索后共鉴定出8 种有机酸，其他两种提取方法的分析结果见表1.酸提法测得的有机酸种类最少，醇提所得浸膏中有机酸的种类最多，3 种方法共检测出10 种有机酸.3 种方法都可检测出的酯化产物对应的有机酸有6 种，分别为乙酰丙酸、富马酸、丁二酸、DL-苹果酸、L-（+）-酒石酸和柠檬酸.同时，以葡萄干中3 种主要有机酸酒石酸、苹果酸和柠檬酸的峰面积作为指标，考察3 种方法对有机酸的提取效率.将3 种提取方法下主要有机酸及其对应的峰面积进行比较，结果如图2 所示.从图2 可见，水提法对酒石酸的提取效率明显高于另外两种方法，水提法和醇提法对苹果酸的提取效率相当，酸提法对苹果酸的提取效率最低.由于葡萄及葡萄制品中含量较高的有机酸是酒石酸、苹果酸和柠檬酸，因而为保证3 种有机酸都有较高的提取效率，后续试验均采用水提法所得样品进行分析.和田红的GC-MS 图谱中鉴定出的8 种有机酸分别为乙酰丙酸、富马酸、琥珀酸、DL-苹果酸、L-（+）-酒石酸、柠檬酸、十六碳酸和十八碳酸，其中含量较高为苹果酸和酒石酸.

图1 和田红甲酯化全扫描总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of esterified Hotan Red

表1 3 种提取方法的比较Table 1 The comparison of three different extraction methods

图2 不同提取方法有机酸峰面积柱状图Fig.2 The histogram of peak area of organic acids extracted by different methods

将其他7 种葡萄干采用同样的方法提取，甲酯化后进样分析，结果见表2.8 种葡萄干中共鉴定出的有机酸种类多达17 种，品种不同，所含有机酸的种类差异较大.以上8 种葡萄干均含有的有机酸为乙酰丙酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸和十六碳酸.含有机酸种类最多的品种是索索，索索除含共有的有机酸外，还含有草酸、琥珀酸、戊二酸、2-甲氧基丁二酸、3-羟基-3-甲基-1，5-戊二酸、邻苯二甲酸、反-9，12-十八碳二烯酸、7，10，13-十六碳三烯酸和十八碳酸.含有机酸种类最少的是和田红和无核白，其中，无核白除含共有的有机酸外，还含有乳酸、邻苯二甲酸和反-9，12-十八碳二烯酸.含量较少的戊二酸、2-甲氧基丁二酸、3-羟基-3-甲基-1，5-戊二酸和7，10，13-十六碳三烯酸只有某个品种的葡萄干才含有.在这些有机酸中，酒石酸、苹果酸和柠檬酸是葡萄制品中最重要的有机酸，是通过叶片的光合作用产生的，随着葡萄生长周期的延长，产生了其他的酸类物质.对于葡萄干而言，根据葡萄干品种及晾晒方式的不同，在发酵过程中也会产生有机酸.因而，葡萄干中有机酸成分的差异可能与所用葡萄品种有关，也可能与晾晒过程中自身的发酵有关.

在定量分析上，GC-MS 存在一些缺陷，有机酸的挥发性较差，因而需要经过衍生化后再分析，衍生化操作比较麻烦、费时，而且可能存在衍生化不完全的问题，因此本试验选择高效液相色谱法对有机酸进行定量分析.

2.2 HPLC 对葡萄干的定量分析

2.2.1 色谱条件的选择

本试验采用的是C18 反相键合色谱柱，检测对象为葡萄干中含量较多的3 种酸，即酒石酸、苹果酸和柠檬酸.由于3 种酸具有亲水性，在C18 柱上的保留较弱，如果在配制溶液时混入有机溶剂，将会使有机酸在C18 柱上的保留更弱，缩短保留时间，容易出现色谱峰重叠的现象，所以直接使用蒸馏水做溶剂.

首先考察进样量的选择，在相同条件下，将进样量依次设置为5、10、20 μL.结果显示当进样量为5 μL 时，峰形较小；当进样量增大到20 μL 时，峰形过大；当进样量为10 μL 时，峰形适中，故选择进样量为10 μL.

表2 8 种葡萄干中有机酸成分GC-MS 检测结果Table 2 GC-MS results of organic acids composition in different raisins

在pH 为3.2、柱温30 ℃、流速0.5 mL/min 的条件下，把甲醇-磷酸氢二铵缓冲盐溶液的体积比依次调整为1∶99、2∶98、3∶97、5∶95、10∶90，将3 种有机酸混标溶液依次在上述5 个洗脱条件下进样分析，得到混标的分离色谱图.随着甲醇在流动相中所占比例的增大，有机酸的洗脱速度加快，出峰时间提前，甲醇比例过大会导致混标中3 种有机酸的色谱峰发生重叠，不能实现基线分离，而1∶99、2∶98 和3∶97 的分离效果较好，考虑到相同条件下，对色谱柱的保护，采用甲醇-缓冲盐（V/V）为3∶97的流动相对有机酸进行洗脱.

流速会影响有机酸的分离效果，因而考察了不同流速对有机酸标准品色谱图的影响.在检测波长210 nm，进样量10 μL，甲醇-磷酸氢二铵缓冲盐（pH 3.2，体积比为3∶97），柱温30 ℃条件下，分别以0.4、0.5、0.6、0.8 mL/min 的流速进样.结果表明，当流速为0.5 mL/min 时，酒石酸、苹果酸和柠檬酸的保留时间分别为2.53、2.97、3.88 min，随着流速的增加，保留时间降低，且酒石酸和苹果酸的吸收峰发生重叠；当增加到0.8 mL/min 时，3 种有机酸的出峰时间明显提前.这表明流动相的流速过大会导致各物质的吸收峰重叠在一起，不能实现很好的分离，流速过低会使分析时间延长，综合考虑，流动相的速度选择为0.5 mL/min.

由于有机酸可与色谱柱固定相中残留的硅羟基相互作用，出现峰型拖尾变宽的现象.使用磷酸-磷酸氢二铵缓冲盐体系作为流动相时可改善峰型，当其pH 值在2.5～3.2 之间，可有效抑制有机酸中羧基离子的电离，减弱有机酸与硅羟基的相互作用.在检测波长210 nm、进样量10 μL、甲醇-磷酸盐缓冲液（V/V=3∶97）、柱温30 ℃、流速0.5 mL/min 条件下，分别用pH 值为2.5、2.8、3.0、3.2的甲醇-磷酸盐缓冲液作为流动相，考察流动相的最佳pH 值.结果表明，在4 种pH 值条件下，混合标样中的酒石酸、苹果酸和柠檬酸的分离效果相当，考虑到所用色谱柱（Agilent Eclipse XDB-C18）的pH 值适用范围是2～9，最佳适用范围是3～8，而流动相的pH 值越低对仪器的损伤越大，故流动相的pH 值定为3.2.

根据高效液相色谱理论，柱温是影响柱效和分离度的主要原因之一.柱温的升高可以使流动相的黏度降低，同时使树脂的传质效率提高.所以，在较高的流动相流速下，升高柱温可以保证混合物中各成分依然达到较好的分离效果.在检测波长210 nm、流动相pH 值为3.2，V（甲醇）∶V（磷酸氢二铵缓冲盐）=3∶97 的条件下，依次将柱温升高到20、25、30、35、40 ℃，流速为0.5 mL/min，进样分析.结果表明，在这一温度范围内，酒石酸保留时间依次为2.46、2.45、2.53、2.48、2.46 min；苹果酸的保留时间依次为2.89、2.84、2.97、2.88、2.85 min；柠檬酸的保留时间依次为3.81、3.60、3.88、3.53、3.42 min.当柱温升高时，酒石酸和苹果酸的保留时间变化不大，而柠檬酸的保留时间随柱温的升高而提前.且柱温为40 ℃时，混标中柠檬酸的色谱峰变宽，峰形不够尖锐.在同等的分离效果的情况下，综合对柱子性能的保护和对分离效率及柱效的考虑，选择柱温30 ℃作为色谱分离条件.

综上所述，选定的有机酸最佳分离条件为：检测波长210 nm，柱温30 ℃，流动相3∶97（V/V）的甲醇-磷酸氢二铵缓冲盐溶液（pH=3.2），流速0.5 mL/min，进样量10 μL.在此分离条件下，将3 种有机酸混标进样分析，由图3 可见，3 种有机酸达到了很好的分离效果.

2.2.2 有机酸的定量工作曲线

图3 混合标准有机酸液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of mixed organic acids standards

将不同浓度的混合有机酸标样，经0.45 μm滤膜过滤到色谱瓶中，浓度从低到高依次进样，平行进样5 次，记录各自的峰面积，以浓度对平均峰面积进行线性回归，得到标准工作曲线，用外标法对3 种有机酸进行定量.其线性拟合方程、线性范围及相关系数见表3.酒石酸在0.019 8～0.198 mg/mL 的浓度范围内，其浓度与峰面积呈线性关系，相关系数为0.997 3，线性关系良好.苹果酸和柠檬酸的相关系数分别为0.999 0、0.997 7，在待测样品浓度范围内，两种有机酸都能保持良好的线性关系，可以保证外标法定量的准确性.

表3 各种有机酸的峰面积回归分析Table 3 Regression analysis of organic acids

2.2.3 HPLC 的精密度与重复性

取同一混合标样平行测定5 次（每隔2 h 进一次样），测定其保留时间及峰面积，计算相对标准偏差（RSD），以峰面积的RSD 及保留时间的RSD对仪器的精密度进行考察，其结果如表4 所示.3种有机酸保留时间的相对标准偏差在0.11%～0.18%范围内，峰面积的相对标准偏差在0.11%～1.85%之间，表明在确定的色谱条件下，保留时间与峰面积基本恒定，本方法具有较高的精密度.

以无核白鸡心为例，采用相同的提取方法平行5 次试验，分别进行液相色谱分析，以考察方法的重现性.测得无核白鸡心中酒石酸、苹果酸、柠檬酸的平均含量分别为5.08%、0.71%、0.32%，其相对标准偏差分别为1.68%、2.65%和2.04%，该方法重现性较好.

2.2.4 方法的加标回收率

称取无核白鸡心20.00 g，准确加入1.01 g 酒石酸、0.14 g 苹果酸和0.06 g 柠檬酸（加入量近似为葡萄干样品中3 种酸含量的50%），采用相同的提取方法平行5 次试验，分别进行液相色谱分析.测得酒石酸、苹果酸、柠檬酸的平均回收率分别为96.54%、96.28%和102.30%，其相对标准偏差分别为1.98%、2.36%和4.32%，表明该方法定量分析葡萄干中3 种主要有机酸的准确度较高.

表4 有机酸保留时间及峰面积的重现性Table 4 Reproducibility of retention time and peak area of organic acids

2.2.5 8 种葡萄干中有机酸的定量分析

分别取8 种葡萄干样品，按照确定的提取方法制备浸膏，采用优化后的色谱条件进样分析（平行进样5 次），用外标法测定3 种有机酸的含量.以无核白鸡心为例，其色谱图如图4 所示.8 种葡萄干样品的有机酸定量分析结果见表5.

从表5 可以看出，8 种葡萄干中均含有酒石酸、苹果酸和柠檬酸.其中，酒石酸含量最高，苹果酸和柠檬酸的含量相对较低.在同一品种葡萄干中有机酸的含量高低均表现为酒石酸＞苹果酸＞柠檬酸.在8 种葡萄干中，酒石酸含量最高的是无核白（5.66%），最低的是木纳格（2.36%）；苹果酸含量最高的是马奶子（0.79%），最低的是索索（0.19%）；柠檬酸含量最高的是马奶子（0.65%），最低的是索索（0.10%）.3 种有机酸含量总和最高的是马奶子（6.83%），最低的是木纳格（2.75%）.

图4 无核白鸡心有机酸色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of organic acids in Centennial Seedless

表5 不同品种葡萄干中有机酸含量Table 5 The contents of organic acids in different raisins %

3 结论

通过GC-MS 检测发现，从8 种葡萄干中共检测出17 种有机酸，单一品种中最多可检测出14 种有机酸，最少可检测出8 种有机酸.由于原材料品种及晾晒方式的差别，8 种葡萄干中所含有机酸的种类有较大差别，其共有的有机酸为乙酰丙酸、DL-苹果酸、L-（+）-酒石酸、柠檬酸和十六碳酸.采用Agilent Eclipse XDB-C18（4.6×150 mm，5 μm）色谱柱，以甲醇-0.01 mol/L 磷酸氢二铵-磷酸缓冲盐溶液（pH 3.2，体积比3∶97）为流动相，在流速0.5 mL/min、波长210 nm 条件下可较好地测定葡萄干中的有机酸含量.8 种葡萄干的定量测定结果表明，葡萄干中富含酒石酸、苹果酸、柠檬酸等，其含量各不相同，但总体而言，酒石酸在各品种葡萄干的有机酸含量中均占主导地位，其次是苹果酸，含量最少的是柠檬酸，这一结果也与相关报道相一致.酒石酸含量从高到低的品种顺序是：无核白、索索、巨峰、无核白鸡心、马奶子、无核紫、和田红和木纳格.

［1］赵国玲，杨华武，刘佳佳，等.一种植物内生菌生物转化葡萄干提取物及其制备和在烟草加香中的应用：中国，201110342923.1［P］.2011-11-03.

［2］Ghrai F，Lahour L，Brahm F，et al.Physico chemical composition of different varieties of raisins（Vitis vinifera L）from Tunisia［J］.Industrial Crops and Products，2013，43:73-77.

［3］潘雪燕，李颖.广西山葡萄中有机酸的分析［J］.广西轻工业，2010（12）：16-17.

［4］谭志静.葡萄果肉和葡萄皮有机酸含量的高效液相法测定［J］.安徽科技学院学报，2007，21（2）：31-34.

［5］成冰，张京芳，徐洪宇，等.不同品种酿酒葡萄有机酸含量分析［J］.食品科学，2013，34（12）：223-228.

［6］周晓明，卢春生，郭春苗，等.高效液相色谱法测定葡萄中有机酸的含量［J］.新疆农业科学，2011，48（4）：651-654.

［7］张军，韩英素，高年发，等.HPLC 法测定葡萄酒中有机酸的色谱条件研究［J］.酿酒科技，2004（2）：91-93.

［8］梁茂雨，刘钢湖.红提葡萄中有机酸成分的GC-MS 分析［J］.食品研究与开发，2007，128（10）：148-149.

［9］唐美华，屠春燕，薛亚芳，等.毛细管电泳法测定葡萄酒中的有机酸含量［J］.食品科学，2009，30（8）：209-211.

［10］崔婧，段长青，潘秋红.反相高效液相色谱法测定葡萄中的有机酸［J］.中外葡萄与葡萄酒，2010（5）：25-30.

［11］Zheng Y J，Duan Y T，Zhang Y F，et al.Determination of organic acids in red wine and must on only one RP-LC column directly after sample dilution and filtration［J］.Chromatographia，2009，69（11-12）:1391-1395.

［12］张颖，张建.利用HPLC 和GC 全面分析葡萄醋中的有机酸［J］.中国调味品，2006（2）：49-53.

［13］王海蓝，李雪萍，陈维信.离子色谱法测定贮藏期间菠萝果实的有机酸变化［J］.热带作物学报，2010，31（10）：36-39.

［14］冯雅斌，杜靓，温静.薄层色谱法在药物分析中的应用及研究进展［J］.疾病监测与控制，2011，5（1）：45-48.

［15］陈虹颖，樊梦原，问亚琴，等.几个酿酒葡萄品种及品系的有机酸分析［J］.中外葡萄与葡萄酒，2012（3）：12-15.