脂肪酶催化红花油环氧化反应的研究

刘瑞丽，刘 伟，毕艳兰

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

0 引言

环氧化反应是指在化合物双键两端碳原子间加上一原子氧形成三元环的氧化反应.环氧植物油是由天然植物油与过氧化物环氧化得到的一类含有环氧基团的改性油脂.环氧植物油是一种可降解、可再生的环保型增塑剂，与传统的邻苯类增塑剂相比，有耐热、耐光、无毒和稳定性好等特点.在许多国家，环氧植物油可直接用于食品、药品的包装材料，也可用于玩具及家庭装饰材料的助剂.此外，环氧植物油还可以用作润滑剂、稳定剂、涂料添加剂、生物聚合物、合成树脂等，具有广阔的市场前景[1-7].可用于环氧化反应的植物油富含不饱和脂肪酸，如大豆油、玉米油、葵花籽油、菜籽油、芝麻油、棉籽油、桐油、花生油、红花油和亚麻籽油等[8-10].红花籽油又称红花油，是以红花籽为原料制取得到的，它外观呈淡黄色至黄色，有轻微的果仁味.红花油中约有90%不饱和脂肪酸，其中亚油酸含量在73%～85%[11-12]，其碘值较高，是制备环氧油脂的理想原料之一.目前采用化学法制备各种环氧化油脂的研究较多，但化学法多采用强酸作催化剂，对设备的腐蚀性较大[13-14].

本课题以红花油为原料，甲苯为反应溶剂，脂肪酶Novozym435 为催化剂，脂肪酸为携氧剂，双氧水为环氧化试剂进行环氧化反应，制备环氧红花油.考察了反应时间、反应温度、双氧水用量、酶用量、脂肪酸用量对红花油环氧化反应的影响.

1 材料与方法

1.1 试验材料

乡味珍低温压榨红花籽油：压榨三级，酒泉市肃州区新地新一酒坊，碘值147.65 g/100 g，酸值0.05 mg/g，过氧化值12.87 mmol/kg；Novozym435：7 000 PLU/g，丹麦诺维信公司；硬脂酸：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；30%过氧化氢：分析纯，洛阳化学试剂厂；0.15 mol/L NaOH 溶液、1%酚酞指示剂、甲酚红-百里香酚蓝混合指示液：自制.

1.2 仪器与设备

GC-6890N 型气相色谱仪：美国Agilent 公司；DF101-Z 控温磁力搅拌器、SHZ-D 循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；2XZ-2 型旋片式真空泵：北京中兴伟业仪器有限责任公司；BS210s 电子天平：赛多利斯天平有限公司.

1.3 试验方法

在250 mL 三口圆底烧瓶中加入红花油5 g，一定量的硬脂酸和脂肪酶Novoyzm435，甲苯30 mL作为溶剂，置于水浴锅中反应.在搅拌情况下，将一定量的30%过氧化氢在10 min 内逐滴加至反应混合物中，保持恒温，反应一定时间.

1.4 产品纯化

环氧化反应完成后，加入过量的氢氧化钠溶液中和硬脂酸，将所得混合物通过真空抽滤进行分离.酶颗粒及脂肪酸的钠盐会留在滤纸上方，环氧油及溶剂等作为滤液收集在抽滤瓶中.将滤液转移至分液漏斗中，用热水水洗至中性（pH 试纸检测）.水洗后，产品中的微量水分用无水硫酸钠除去；残留的溶剂，在减压条件下，用旋转蒸发仪除去，即得到最终产品环氧红花油.

1.5 分析方法

1.5.1 环氧值的测定

环氧值的测定采用GB/T 1677—2008 方法.酸价的测定采用GB/T 5530—2008 方法.碘值的测定采用GB/T 5532—2008 方法.过氧化值的测定采用GB/T 5538—2008 方法.环氧红花油理论环氧值与环氧值转化率按下式计算：

式中：OOex为试验环氧值；OOth为理论环氧值；RCO为环氧值转化率；IV 为碘值；Ai为碘的相对分子质量126.90；Ao为氧的相对分子质量16.0.

经测定，IV=144.87 g/100 g.计算得出理论环氧值OOth=8.36%；本试验的测定环氧值OOex=7.25%；环氧值转化率RCO=（7.25/8.36）×100%=86.66%.

1.5.2 红花油组分分析

油样甲酯化方法采用GB/T 17376—2008 方法，气相色谱分析采用GB/T 17377—2008 方法.气相色谱的条件如下.仪器：Agilent 6890N；检测器：氢火焰离子化检测器；BPX-70 毛细管脂肪酸分析柱：30.0 m×320 μm×0.50 μm；进样口温度：230 ℃；柱温：210 ℃；检测器温度：300 ℃；氮气流速：1.0 mL/min；氢气流速：35 mL/min；空气流速：400 mL/min.

2 结果与讨论

2.1 红花油脂肪酸组成分析

红花油的脂肪酸组成分析结果见表1.

表1 红花油中主要脂肪酸组成（面积归一化法）Table 1 Fatty acid composition of safflower oil(Area normalization method)

由表1 可知，红花油中饱和脂肪酸含量约为9.65%，不饱和脂肪酸含量约为89.81%.环氧化反应是在脂肪酸双键两端碳原子间加上一原子氧形成三元环的氧化反应.因此，红花油是制备环氧化油脂的理想原料.

2.2 反应温度对红花油环氧化反应的影响

本试验所选用的催化剂为脂肪酶Novozym435，其活性受温度的影响较大.反应温度不仅影响反应物分子中活化分子的比例，还影响催化剂的活性.因此，对反应温度的研究至关重要.本试验环氧化反应条件为红花油5 g、酶0.15 g（油质量的3%）、双氧水10 mL、硬脂酸0.000 5 mol、反应时间4 h，考察了不同温度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）对环氧化反应的影响，结果如图1 所示.

图1 反应温度对环氧值的影响Fig.1 Effect of reaction temperature on oxirane oxygen

由图1 可知，当温度小于40 ℃时，随着反应温度的升高，红花油的环氧值随之增加.反应温度为40 ℃时，其环氧值达到最大，为2.10%，此时的转化率为25.12%.与最初的30 ℃相比，环氧值升高了0.36 个百分点，转化率升高了4.3 个百分点.之后随着反应温度的升高环氧值反而降低，并且在反应温度高于50 ℃后产物环氧值骤降.这是由于本试验所选用的催化剂为脂肪酶Novozym435，其最适反应温度为45 ℃左右.当反应温度低于40℃时，酶的活性受抑制，其对反应的催化作用发挥得不够充分；而温度过高又使酶部分失活，失活后的酶对反应没有催化作用，故而所得产品的环氧值较低.另外，在一定范围内提高反应温度，反应物分子动能增加，进而分子间的有效碰撞几率也随之升高，反应加速.但产物中的环氧基团、双氧水及中间产物过氧酸都不耐高温，反应温度过高，会加剧环氧基团的开环反应及双氧水和过氧酸的分解，使反应平衡逆向移动，产品环氧值下降.此外，反应温度过高，不仅浪费能源，还导致碳碳双键发生聚合反应生成着色物，产品颜色加深，质量变差.综合考虑，环氧化反应以40 ℃为宜.

2.3 硬脂酸用量对红花油环氧化反应的影响

硬脂酸在环氧化反应中作为携氧剂即氧的载体，它的存在是环氧化反应能顺利进行的前提.环氧化反应中，脂肪酸在酶的催化作用下被H2O2氧化生成过氧脂肪酸，过氧脂肪酸再使油脂的不饱和双键环氧化.其过程如图2 所示.

图2 环氧化反应的过程Fig.2 The mechanism of epoxidation reaction

因此，硬脂酸用量是环氧化反应的影响因素之一.本试验环氧化反应条件为红花油5 g、酶0.15 g（油质量的3%）、反应温度40 ℃、双氧水10 mL、反应时间4 h，考察了硬脂酸的用量（0.000 5 mol、0.001 mol、0.002 mol、0.003 mol、0.004 mol、0.005 mol、0.006 mol、0.007 mol、0.008 mol）对红花油环氧化反应的影响，结果如图3 所示.

图3 硬脂酸用量对环氧值的影响Fig.3 Effect of stearic acid amount on oxirane oxygen

由图3 可知，当硬脂酸用量小于0.006 mol时，随着硬脂酸用量不断的增加，所生成的环氧红花油的环氧值也在逐渐上升.当硬脂酸用量增加到0.006 mol 时，红花油的环氧值达到5.57%，此时的转化率为66.63%.之后，随着硬脂酸用量的增加，环氧值反而有所降低.这是由于硬脂酸在反应体系中可以转移活性氧，如果其浓度过低，则反应生成的过氧硬脂酸浓度低，不利于环氧化反应的正向移动；若硬脂酸用量过多，则体系的酸度增加，催化剂中毒，过多的硬脂酸还会使环氧基团发生开环反应，进而使产品环氧值下降.综合考虑，硬脂酸用量以0.006 mol 为宜.

2.4 反应时间对红花油环氧化反应的影响

反应时间对红花油的环氧化有显著影响.本试验环氧化反应条件为红花油5 g、酶0.15 g（油质量的3%）、双氧水10 mL、硬脂酸0.006 mol、反应温度40 ℃，考察了不同反应时间（2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h）对红花油环氧化反应的影响，结果如图4 所示.

图4 反应时间对环氧值的影响Fig.4 Effect of reacton time on oxirane oxygen

由图4 可以看出，随着反应时间的延长，产物的环氧值也在逐渐增加，到10 h 达到最大值.在2～10 h 内环氧化反应向着生成环氧基团的方向移动，环氧化物逐渐增多，反应10 h 时，体系中环氧基团累计最多，产物环氧值达到最大，为6.85%，此时的转化率达到81.94%.10 h 后，由于酸的存在，催化剂中毒，随着反应时间的延长生成的水逐渐增多，使反应生成的环氧基团发生开环反应，因此，产品环氧值会有所下降.其原理如图5 所示.

图5 酶催化环氧化反应与环氧基团开环副反应Fig.5 Enzymatic epoxidation and the side reactions

为了节约成本及减少能源消耗，在保证环氧值达到要求的前提下，应尽可能缩短反应时间.综合考虑，环氧化反应时间以10 h 为宜.

2.5 加酶量对红花油环氧化反应的影响

酶作为反应的催化剂，能降低反应的活化能，增大活化分子的百分比，直接影响环氧化反应达到平衡的时间.本试验环氧化反应条件为红花油5 g、反应温度40 ℃、双氧水10 mL、硬脂酸0.006 mol、反应时间10 h，考察了酶的用量（1%、2%、3%、4%、5%）对红花油环氧化反应的影响，结果如图6 所示.

图6 加酶量对环氧值的影响Fig.6 Effect of enzyme amount on oxirane oxygen

由图6 可知，在其他反应条件相同时，酶的用量影响产品的环氧值.在加酶量小于4%时，随着酶添加量的增加，环氧值也在不断增加.酶用量为1%时，产品的环氧值为6.09%，此时的转化率为72.79%；酶的用量为4%的时候，产物的环氧值达到最大，为7.25%，此时的转化率为86.66%，之后随着加酶量的增加环氧值有轻微的下降.可见，当酶的用量达到饱和后，再增加酶的用量反而会使反应物的浓度相对降低，不利于反应的正向移动，于反应结果无益.综合考虑，酶的最适添加量为油质量的4%，即0.20 g.

2.6 双氧水用量对红花油环氧化反应的影响

双氧水作为环氧化反应的携氧剂，其用量是影响红花油环氧化的重要因素之一.本试验环氧化反应条件为红花油5 g、酶0.20 g（油质量的4%）、反应温度40 ℃、硬脂酸0.006 mol、反应时间10 h，考察了双氧水的用量（5 mL、7.5 mL、10 mL、12.5 mL、15 mL）对红花油环氧化反应的影响，结果如图7 所示.

图7 双氧水用量对环氧值的影响Fig.7 Effect of the H2O2 amount on oxirane oxygen

由图7 可知，当双氧水用量小于10 mL 时，增加双氧水的用量，产品的环氧值也随之增加.双氧水的用量增加到10 mL 时，产品的环氧值达到7.25%，此时转化率为86.66%，与最初的5 mL 添加量相比，产品环氧值升高了0.61 个百分点，转化率升高了7.23 个百分点.然而，随着双氧水用量的进一步增加，产品的环氧值反而会下降.这主要是由于当双氧水用量较少时，环氧化反应的直接参与者（过氧酸）生成量较少，环氧化反应不能正常的进行，因此环氧化反应正向移动，产品环氧值也随之增加.本试验添加的是30%双氧水，当其用量过多会增大体系中水分的含量，导致环氧基团的开环副反应加剧，使环氧值降低.综合考虑，环氧化反应中双氧水的添加量以10 mL 为宜.

2.7 正交试验

为了优化红花油环氧化的最佳条件，根据上述单因素试验结果，在脂肪酶添加量为4%的基础上，选取反应温度、硬脂酸用量、双氧水用量及反应时间4 个因素作为考察对象，各取3 个水平，利用L9(34)表进行正交试验.因素与水平设计及结果见表2.

表2 正交试验设计、结果及极差分析Table 2 Orthogonal experimental design,results,and range analysis

从表2 可以看出，极值R 能够反映出4 个因素对环氧值的影响大小为：D＞A≈B＞C，即因素的影响顺序为反应时间＞反应温度≈硬脂酸用量＞双氧水用量.因此得到最佳正交组合A2B2C3D2，即反应时间10 h，反应温度40 ℃，硬脂酸用量0.006 mol，双氧水用量10 mL.

验证试验：以上述条件为准，其他条件不变的情况下，做验证试验，得到环氧值为7.25%，转化率为86.66%.

3 结论

研究了影响红花油环氧化的单因素（反应时间、反应温度、双氧水用量、酶的用量、硬脂酸的用量）并进行了多因素正交试验，得到了红花油环氧化的最佳反应条件为红花油5 g、甲苯30 mL、双氧水用量10 mL、脂肪酸用量0.006 mol、酶用量4%、反应温度40 ℃、反应时间10 h.在此工艺条件下制得的环氧红花油的环氧值为7.25%，环氧值转化率为86.66%.

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