白鲳鱼肠道中产蛋白酶菌的筛选、鉴定及产酶条件

李 静，陈维新，邓毛程

（广东轻工职业技术学院，广东 广州 510300）

0 引言

蛋白酶是重要的水解酶类，主要由动物、植物和微生物等生物合成，目前在工业化运用中最为成功、产量最大[1]，并广泛应用于洗涤剂、食品、药品、皮革、纺织和废物处理等工业领域.由于水产品蛋白酶酶解产物具有较高的营养价值和功能特性，含有丰富的生物活性肽、氨基酸以及高度不饱和脂肪酸等保健成分，近年来，蛋白酶开始出现在水产品加工过程中，被广泛应用于饲料、食品、化工、医药等各个领域[2].蛋白酶制剂在整个酶制剂市场的占有率已超过65%[3]，且微生物来源的酶制剂已居主导地位.微生物来源的蛋白酶除了具备动、植物蛋白酶的特性，还具有产量高、生产成本低、易于实现工业化生产等优点[4].目前，应用于蛋白酶工业化生产的微生物较多，细菌主要有地衣芽胞杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）、短小芽胞杆菌（Bacillus pumilus）、解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）等芽胞杆菌属微生物[4-5]，但国内目前在蛋白酶制剂的研究开发方面与国外相比，仍有较大差距，因此从特殊来源、特殊环境，例如鱼类肠道的低温环境中筛选产酶能力强的新型菌种具有重要意义.本试验从广东省沿海特定水产品海水白鲳的肠道中筛选高产蛋白酶产生菌株，通过富集培养、平板筛选、摇瓶复筛等综合手段获得一株产酶能力较强的菌种EF21，采用形态特征、生理生化试验，以及分子鉴定16S rDNA 分析方法鉴定该菌在进化系统中的种属，并以蛋白酶活力作为判断指标，研究了产酶最优氮源、初始pH、温度、最佳产酶时间等，拟通过优化各发酵参数来提高产酶能力，以期获得较好的蛋白酶产生菌株，为将来进一步开展酶学特性研究、工业化生产提供基础数据.

1 材料与方法

1.1 材料与培养基

海水白鲳鱼：来自琼州海峡；酪氨酸：分析纯，Sigma 公司；酪蛋白及其他试剂均为国产分析纯.

富集培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，KH2PO42 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，pH 7.0.

平板筛选培养基：葡萄糖5 g/L，酪蛋白10 g/L，蛋白胨5 g/L，KH2PO41 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0.

斜面培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.0.

种子培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，pH 7.0.

基础发酵基：葡萄糖50 g/L，蛋白胨10 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L，pH 7.0.

1.2 仪器与设备

FA2204 型电子分析天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司；JA5003 型精密电子天平：杭州中拓仪器有限公司；YX-280D 型蒸汽灭菌器：合肥华泰医疗设备有限公司；SW-CJ-2FD 型超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；SPX-100-Z 型生化培养箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；A200 型基因扩增仪：杭州朗基科学仪器有限公司；RDYSP1Z 型核酸电泳仪：北京荣阳经典科技有限公司；GI-1 型凝胶成像系统：通宝达成科技（北京）有限公司；S-3000N 型扫描电镜、H-7650 型透射电镜：日本日立公司.

1.3 平板筛选

剖开鲜活的白鲳鱼，取出肠道，经高速匀浆机捣碎，称取10 g 捣碎组织，接入100 mL 的富集培养基，置于24 ℃、200 r/min 的条件下培养20 h.将富集培养基稀释成系列浓度，分别涂布于平板筛选培养基上，在24 ℃下培养48 h，观察各菌落周围是否有透明圈，挑取具有较大透明圈的单菌落，接入斜面培养基，经培养，备用.

1.4 摇瓶筛选

以1.3 中筛选所得的各菌株为筛选对象，将它们接入种子培养基，在24 ℃、200 r/min 的条件下振荡培养16 h，以10% 的接种量，将种子培养液接入发酵培养基，于同样条件下进行发酵，在36～72 h 时间内定期测定发酵液的蛋白酶活力，比较各菌株的最高值，筛选出高产菌株.

1.5 高产菌种的鉴定

对优选菌株，采用普通光学显微镜、扫描电镜和透射电镜观察菌体形态.采用16S rDNA 进行分子生物学鉴定，首先提取高产菌株的16S rDNA，经PCR 扩增、纯化，送至测序公司进行序列检测，然后在NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）中检索同源性，以Neighbor-joining 法构建系统发育树[6].参照《Bergy’s Manual of Determinative for Bacteriology》中的试验方法[7]，对菌种进行生理生化特征分析.

1.6 菌种产蛋白酶的氮源

改变基础发酵培养基的氮源，分别以酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、尿素、硫酸铵为唯一氮源，通过摇瓶发酵和测定发酵液中的蛋白酶活力，优选最佳的氮源.

1.7 菌种产酶的初始pH 和温度

将培养基的初始pH 分别调节至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和8.5，接种后，于24 ℃、200 r/min 的条件下进行发酵.另外，将接种后的发酵培养基（pH 7.0）在不同温度、200 r/min 的条件下进行发酵.在发酵过程中，定期测定发酵液中的蛋白酶活力，以最高值为依据，优选产酶的最佳初始pH 和温度.

1.8 菌种产蛋白酶的时间

在最佳的温度和初始pH 下，以最优化的培养基进行摇瓶发酵，每隔8 h 测定发酵液中的蛋白酶活力，根据蛋白酶活力变化情况，确定最佳的产酶时间.

1.9 蛋白酶活力的测定

采用Folin 试剂法测定发酵液中的蛋白酶活力[8].

样品测定前，配制一系列浓度的酪氨酸溶液，分别吸取1 mL 酪氨酸溶液，与5 mL 的0.4 mol/L碳酸钠溶液、1 mL 的Folin 试剂混合，于40 ℃水浴中显色20 min，于660 nm 波长下测定吸光度.以酪氨酸浓度为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程.

样品测定时，先将酪蛋白溶于pH 7.0 的缓冲液，配制成20 g/L 的酪蛋白溶液，并置于40 ℃水浴中预热；然后，将发酵液的pH 调节至7.0，于6 000 r/min、4 ℃下离心20 min，去除菌体，适当稀释上清液，吸取1 mL 稀释液，经40 ℃水浴预热5 min，加入1 mL 酪蛋白溶液，置于40 ℃水浴中反应20 min；最后，加入2 mL 的0.4 mol/L 的三氯乙酸终止反应，经10 000 r/min 离心20 min，吸取1 mL 上清液，与5 mL 的0.4 mol/L 碳酸钠溶液、1 mL 的Folin 试剂混合，于40 ℃水浴中显色20 min.同时，需制备一个对照体系，即先将待测的蛋白酶液与三氯乙酸混合，于40 ℃水浴中作用20 min，使蛋白酶失活，再加入酪氨酸溶液，其余步骤同上.以对照体系为空白，在660 nm 的波长下测定吸光度.根据吸光度测定值和酪氨酸标准曲线，计算发酵液中的蛋白酶活力.

酶活力单位定义：在40 ℃和pH 7.0 的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1 μg 酪氨酸的酶量，以U表示.

2 结果与讨论

2.1 蛋白酶产生菌的筛选

富集培养液经酪蛋白平板分离，挑取了62 株在菌落周围具有明显透明圈的菌株.这些菌株再经摇瓶发酵试验，表现出不同的产酶能力，图1 是产酶能力较高的8 株菌.从图1 看出，菌种EF21发酵液的蛋白酶活力最高，故将其作为进一步研究的对象.

图1 菌种筛选结果Fig.1 Screen result of 8 strains

2.2 高产菌种的鉴定

菌种EF21 的菌体经革兰氏染色，在普通光学显微镜下观察，呈阳性.在扫描电镜（×8.0 k）、透射电镜（×2.5 k）下观察，如图2 所示，菌体呈杆状，周生鞭毛，大小为（2.1～4.2）μm ×（0.9～1.0）μm.菌种EF21 的16S rDNA 经扩增、测序，可获得1 227 bp 的序列，在NCBI 中检索该序列的同源性，发现其与许多蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）的同源性达96%～97%.采用Neighbor-joining 法构建系统发育树，菌种EF21 的系统发育树如图3 所示，菌种EF21 与Bacillus cereus Bc（登录号:KC814644.1）的亲缘关系最近，因而可鉴定菌种EF21 为蜡样芽胞杆菌.菌种EF21 的生理生化试验结果如表1 所示，在表1 中还列举了早期文献报道的两株蜡样芽胞杆菌的生理生化特征[9-10]，通过比较，发现它们大部分特征相似，但菌种EF21 能够在较低温度下生长，估计与其来源于海洋环境有关.菌种EF21 与数据库中菌种的最大同源性仅为97%，且生长温度较低，可能是新发现的微生物菌种.

图2 菌体在扫描电镜和透射电镜下的照片Fig.2 SEM and TEM photographs of strain EF21

图3 菌种EF21 的系统发育树Fig.3 The sequence phylogenetic analysis of strain EF21

2.3 氮源对产酶的影响

培养基分别采用不同的氮源，发酵结果如图4所示.从图4 可以看出，相对于无机氮源而言，有机氮源有利于菌种EF21 产蛋白酶，这与有机氮源含有诱导作用的肽链有关.其中，以蛋白胨为氮源，菌种EF21 的产酶效果最好，虽然菌种EF21 是新型菌种，但试验结果与早期文献[11]的其他菌种具有相同之处.

表1 菌种EF21 和两株蜡样芽胞杆菌的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain EF21 and two other Bacillus cereus

图4 不同氮源对产蛋白酶的影响Fig.4 Effect of different nitrogen sources on the yield of protease

2.4 初始pH 和温度对产酶的影响

初始pH 和温度对菌种EF21 产蛋白酶的影响如图5 所示.初始pH 过高或过低均不利于菌种EF21 产蛋白酶，适宜的初始pH 范围为7.0～7.5，在pH 7.5 时的产酶量最大.温度对产酶的影响较为明显，16～24 ℃有利于菌种EF21 产蛋白酶，其中最佳的产蛋白酶温度为20 ℃.偏碱性、较低温度的产酶条件与海洋环境特征一致，表明菌种产酶特性与菌种来源密切相关.国内关于产蛋白酶的低温菌种的报道不多，肖峰等[12]从黄海海域筛选得到一株产中性蛋白酶菌种Aranicola proteolyticus XF1，最适产酶温度为25 ℃；王金富等[13]从南极海水中获得3 株假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）的菌种和1 株科尔韦尔氏属（Colwellia）的菌种，产蛋白酶的最适温度为10 ℃左右.菌种EF21 产蛋白酶的温度较低，在低温环境中具有应用潜力.

图5 初始pH 和温度对产蛋白酶的影响Fig.5 Effect of fermentation conditions on the yield of protease

2.5 最佳产酶时间的确定

在产蛋白酶的最佳条件下，菌种EF21 的产酶时间曲线如图6 所示.在发酵32 h 以内，产酶量较低；随着时间延长，发酵液中蛋白酶活力逐渐增加，64 h 时达到最高；在发酵64 h 以后，由于营养物质竭尽和发酵液pH 下降，蛋白酶活力呈下降趋势.本试验条件下的最佳产酶时间为64 h，此时发酵液中蛋白酶活力达1 292 U/mL.在蛋白酶活性单位定义的相同情况下，发酵液中蛋白酶活力的较高水平一般为600～800 U/mL[5，14]；蔡婉玲等[1]报道了1 株产蛋白酶菌的突变株，其发酵液的蛋白酶活力达1 845 U/mL.相对于文献报道的数据，菌种EF21 具有较强的产酶能力.

图6 发酵时间对产蛋白酶的影响Fig.6 Effect of fermentation time on the yield of protease

3 结论

从海水白鲳鱼肠道中筛选得到一株蛋白酶高产菌种EF21，经鉴定，该菌种被确定为新发现的蜡样芽胞杆菌.菌种EF21 产蛋白酶的最佳氮源为蛋白胨，最佳的初始pH、温度和时间分别为pH 7.5、20 ℃和64 h.在最佳的产酶条件下，发酵液中蛋白酶活力达1 292 U/mL.菌种EF21 适宜在较低温度下产酶，在低温环境中具有巨大的应用潜力.由于该菌种是新发现的海洋微生物，其毒性试验、所产蛋白酶的酶学性质以及发酵条件优化等工作仍有待继续开展，进一步促进工业化应用.

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