通心络对早期糖尿病肾病大鼠血管内皮生长因子表达的影响

李娇阳 高彦彬 周盛楠 邹大威 朱智耀 张娜 崔方强 刘静

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见的慢性微血管并发症之一，也是糖尿病患者的主要死亡原因之一。在中国近1.14 亿的糖尿病患病人群中，2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)约占90.0%，其并发肾病的患病率为34.7%［1-2］。DN 早期的病理特征表现为肾小球的高滤过、高灌注、高内压，肾小球肥大，继而导致系膜区增宽和基底膜增厚，最终发生肾小球硬化［3］。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)与DN 的发生发展密切相关，VEGF 的异常表达可能是早期肾脏滤过率升高和尿蛋白排泄增加的重要机制［4］。本研究旨在通过观察通心络对早期DN 大鼠VEGF 表达的影响，探讨通心络对肾脏的保护作用及其部分作用机制，为通心络的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 雄性SD 大鼠40 只，体重180g ～220g，8 周龄，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号:SCXK(京)2012-0001。

1.1.2 高脂饲料 配方为10.0%猪油、20.0%蔗糖、2.5%胆固醇、0.5%胆酸盐和67.0%基础饲料，购自北京科澳协力饲料有限公司，许可证编号:SCXK(京)2009-0012。

1.1.3 药品和试剂 通心络超微粉(人参、水蛭、全蝎、赤芍、蝉蜕、土鳖虫、蜈蚣、檀香、降香、乳香、酸枣仁和冰片等)(批号20121215，河北以岭药业);缬沙坦胶囊(批号X1371，北京诺华制药有限公司)，链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(F1030-F0.5，美国Sigma)，大鼠VEGF 酶联免疫吸附法测定试剂盒(CSB-E04757r，武汉华美)，VEGF 抗体(ab46154，美国Abcam)，Flt1 抗体(ab32152，美国Abcam)。

1.1.4 实验仪器 CareSens POP 血糖仪(爱科来国际商贸有限公司)，BioTek EXL800 酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)，卓越320、330 全自动生化分析仪(上海科华实验系统有限公司)，ELITE200 电泳仪(美国Wealtec)，V-GES 小型垂直电泳槽(美国Wealtec)，PRISM7700 荧光定量 PCR仪(美国ABI)，WD-9413 凝胶成像分析仪(北京市六一仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立与分组 40 只大鼠适应性喂养1 周，随机选取10 只为空白组，喂以基础饲料;其余30 只为造模组，全程喂以高脂饲料。4 周后禁食12 小时，按35 mg/kg 体重一次腹腔注射1%的STZ 溶液(以0.1 mol/L 柠檬酸缓冲液现配现用，pH 4.2 ～4.4，4℃)，空白组注射相当剂量的缓冲液。72 小时后经大鼠尾尖采血测血糖，以空腹血糖(fasting blood glucoce，FBG)≥16.7 mmol/L 为造模成功。稳定5 天后将成模大鼠随机分为模型组、缬沙坦组和通心络组。缬沙坦组予缬沙坦胶囊10 mg/(kg·d)灌胃，通心络组予通心络超微粉0.4 mg/(kg·d)灌胃，空白组及模型组予等量蒸馏水灌胃。治疗8 周。

1.2.2 标本的收集与处理 8 周后金属代谢笼收集24 小时尿液;末次给药后以10%水合氯醛按0.35 mL/100 g 体重麻醉大鼠，腹主动脉取血，部分EDTA 抗凝留取血浆，部分不抗凝留取血清;摘下双侧肾脏，去包膜，左肾称重，右肾取皮质液氮速冻。尿样、血液标本及肾组织-80℃保存备用。

1.2.3 FBG、UAER、Ccr 及KW/BW 的测定 血糖用血糖仪检测;尿微量白蛋白采用酶联免疫吸附法检测，尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rate，UAER)= 白蛋白(mg/mL)×总尿量(mL/24h);自动生化分析仪测定血清肌酐(serum reatinine，Scr)、血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和尿肌酐(urea reatinine，Ucr)，内生肌酐清除率(creatinine clearance rate，Ccr)= 尿肌酐× 总尿量(mL/24h)/血肌酐/1440(min)/体重×100;电子天平测定体重(body weight，BW)和肾重(kidney weight，KW)，肾重指数=KW/BW。

1.2.4 酶联免疫吸附法检测血浆中VEGF 的表达 测试时血浆用原液，反应过程严格按照试剂盒说明书操作，反应终止后5 分钟内用酶标仪在450 nm波长测量各孔的OD 值，计算样本浓度。

1.2.5 Western blot 检测肾组织中VEGF 及Flt1 的蛋白表达 取肾组织裂解后的上清液检测总蛋白，每个样品取相同蛋白含量的粗提液在10% SDSPAGE 胶上电泳分离，转印至PVDF 膜;5%脱脂奶粉封闭振荡1 小时，一抗4℃孵育过夜;5 分钟×3次洗膜，加入二抗室温孵育2 小时，TBST 漂洗5 分钟×3 次;用ECL 试剂暗室内胶片曝光，扫描胶片，用图像分析软件分析目标条带。目的蛋白表达量以目的蛋白/β-actin 的灰度比值表示。

1.2.6 RT-PCR 法检测肾组织中VEGF 及Flt1 的基因表达 采用Trigol 试剂提取总RNA，DNase 处理，使用TOYOBO 反转录试剂盒进行cDNA 的合成，将内参基因(GAPDH)和RT 产物进行扩增;1%琼脂糖凝胶电泳，电泳后凝胶在紫外灯下观察拍照，用凝胶成像分析系统进行半定量分析。以目的基因mRNA 与GAPDH mRNA 吸光度比值表示目的基因mRNA 表达量。引物信息见表1。

表1 实验中的引物信息

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠和KW/BW 的水平

如表2所示:与空白组比较，模型组大鼠FBG、UAER、Ccr 和KW/BW 均明显升高(P ＜0.05);与模型组比较，通心络组UAER、Ccr 和KW/BW(P ＜0.05)均明显降低(P ＜0.05)，FBG 无明显变化(P＞0.05);通心络组与缬沙坦组比较无统计学差异(P＞0.05)。提示通心络单独使用无明显降糖作用，但可以显著改善肾小球高滤过及肾脏肥大，抑制尿白蛋白的排泄，保护肾功能。

表2 各组大鼠常规指标的比较(±s，n=10)

表2 各组大鼠常规指标的比较(±s，n=10)

组别FBG(mmol/L)UAER(mg/24h)Ccr(mL/min/BW* 100g)KW/BW(10 -3)5.7 ±0.4 0.42 ±0.06 0.75 ±0.08 3.02 ±0.23模型组 28.0 ±2.5 1.99 ±0.12 1.84 ±0.30 5.87 ±0.47缬沙坦组 27.4 ±3.7 1.51 ±0.19 1.40 ±0.23 4.87 ±0.60空白组通心络组26.3 ±2.3 1.37 ±0.17 1.31 ±0.24 4.56 ±0.44

2.2 酶联免疫法检测血浆中VEGF 的表达

如表3所示:与空白组比较，模型组血浆VEGF含量明显升高(P ＜0.05);与模型组比较，通心络组血浆VEGF 含量明显降低(P ＜0.05);通心络组与缬沙坦组比较无统计学差异(P＞0.05)。提示通心络具有降低DN 大鼠血浆VEGF 表达的作用。

表3 各组大鼠血浆VEGF 含量的比较(±s，n=10)

表3 各组大鼠血浆VEGF 含量的比较(±s，n=10)

组别 VEGF(pg/ml)6.1 ±2.0模型组 20.0 ±6.9缬沙坦组 11.0 ±3.6空白组通心络组10.6 ±2.8

2.3 western blot 及RT-PCR 检测肾组织中VEGF、Flt1 的表达

如表4所示:与空白组比较，模型组大鼠肾组织的VEGF 及受体Flt1 的蛋白及基因表达量均明显升高(P ＜0.05);与模型组比较，通心络组大鼠肾组织的VEGF 及Flt1 的蛋白及基因表达量明显降低(P ＜0.05);通心络组与缬沙坦组比较无统计学差异(P＞0.05)。提示通心络可以抑制DN 早期大鼠肾组织中VEGF 及受体Flt1 的过度表达。

表4 各组大鼠肾组织中VEGF 及Flt1 的表达(±s，n=6)

表4 各组大鼠肾组织中VEGF 及Flt1 的表达(±s，n=6)

Flt1mRNA组别VEGF 蛋白表达量Flt1 蛋白表达量VEGFmRNA表达量表达量空白组0.27 ±0.03 1.55 ±0.07 1.36 ±0.24 2.11 ±0.27模型组 0.46 ±0.04 2.06 ±0.10 2.56 ±0.28 3.42 ±0.41缬沙坦组 0.35 ±0.03 1.76 ±0.11 1.86 ±0.11 2.88 ±0.26通心络组0.35 ±0.04 1.82 ±0.14 1.70 ±0.19 2.63 ±0.19

3 讨论

DN 的发病机制较为复杂，微循环障碍在DN 的发生发展中起着重要作用［5］。T2DM 并发肾病患者早期表现为肾小球滤过率升高和微量白蛋白尿出现，若得不到重视与治疗病情将持续加重，肾功能呈持续性减退直至发展为终末期肾病。VEGF 是一种促血管内皮细胞生长因子，在肾脏中主要由足细胞产生。高糖、AngⅡ、缺血和缺氧等多种因素均能刺激VEGFmRNA 表达与蛋白分泌增加［6］，并通过Flt1(fam 样酪氨酸激酶受体)信号通路介导DN 早期滤过率的升高和尿蛋白排泄的增加:(1)上调微囊结构蛋白caveolin 的表达，诱导血管内皮VVOs 小孔数目的增加及窗口的开启，导致血管壁通透性增加［7］;(2)激活PI3K/Akt 通路，引起足细胞黏附性降低、脱落增加以及分泌ECM 和Ⅳ型胶原增多，导致血管壁通透性增加［8］;(3)刺激内皮细胞分泌eNOS，增加NO 释放，引起肾小球入球小动脉相对舒张，导致肾小球囊内压的升高［9］。另外，VEGF 还可以特异性地结合VEGFR2 诱导内皮细胞分裂、增殖和迁移，引起早期的肾小球肥大，导致滤过率升高和尿蛋白排泄增加［10］。有研究显示单独阻断AngⅡ1 型受体在抑制AngⅡ作用的同时VEGF 表达亦显著减低，因此，抑制VEGF 表达可能是延缓DN 发生发展的途径之一［11］。

DN 属于中医“消渴”之范畴，高彦彬教授［12］认为DN 是糖尿病迁延日久，久病入络所致，病位在肾，涉及五脏六腑，病机以“肾络瘀滞”为关键。发病之初，病在肝肾，气阴两虚，肾络瘀滞;病程中期，疾病迁延，阴损及阳，脾肾虚衰，肾络瘀阻;病变晚期，肾络瘀结，身体劳损，肾用失司，浊毒内停，五脏受损，气血阴阳衰败而变证峰起。因此，化瘀通络是治疗DN 的重要治疗法则。通心络治疗冠心病心绞痛疗效确切，主要成分包括人参、水蛭、全蝎、赤芍、蝉蜕、土鳖虫、蜈蚣、檀香、降香、乳香、酸枣仁、冰片等十二味中药，全方有益气通络、活血化瘀之效［13］。络病是冠心病及糖尿病微血管并发症等重大疾病的共性病理基础［14］，临床研究证实通心络可有效降低早期DN 患者的尿蛋白排泄率，改善肾功能，联合常规治疗能调节血糖血脂［15］。前期实验研究发现调控降解酶系MMP-9/TIMP-1 抑制细胞外基质沉积可能是通心络保护肾脏功能的作用机制之一［16］。

本研究采用高脂饲料联合小剂量STZ 建立动物模型，两者结合诱导出更接近人类T2DM 的大鼠模型。T2DM 大鼠呈现稳定的高血糖状态，注射STZ1 周后逐渐出现多饮多尿、体型消瘦和精神萎靡等症状;实验结束时模型组大鼠UAER、Ccr 和KW/BW 较空白组均明显升高，符合DN 早期表现。通心络治疗8 周后UAER、Ccr 和KW/BW 较模型组均显著减低，证实通心络可以有效改善DN 大鼠早期的高滤过状态和肾脏肥大，抑制尿白蛋白的排泄，保护肾功能。进一步研究发现通心络能显著降低血浆中VEGF 的含量，下调肾组织中VEGF 及Flt1的基因和蛋白的异常表达，提示通心络对高滤过及蛋白尿的改善作用与抑制VEGF 及其受体Flt1 的表达有关。综上所述，通心络可以多途径、多靶点防治DN的发生发展，抑制VEGF 及其受体Flt1 的异常表达可能是通心络保护肾脏功能的作用机制之一。

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