儿童原发性肾病综合征肾组织CD2AP表达与足细胞损伤相关性的初步探讨

郝 胜 吴 滢 康郁林 陈咏琪 黄文彦 何威逊 朱光华



·论著·

儿童原发性肾病综合征肾组织CD2AP表达与足细胞损伤相关性的初步探讨

郝 胜 吴 滢 康郁林 陈咏琪 黄文彦 何威逊 朱光华

目的 观察原发性肾病综合征(PNS)患儿肾组织CD2AP蛋白和mRNA的表达，探讨其与足细胞损伤的关系。方法 以2012年1月至2013年6月上海市儿童医院收治的PNS且行肾活检的病例为PNS组，以同期我院行泌尿系统肿瘤切除患儿为对照组，取远离肿瘤并病理确认为正常肾组织。PNS组和对照组均行常规切片染色，光镜观察肾脏组织病理改变，电镜观察足细胞的结构变化，分别采用qPCR和免疫组化测定肾组织CD2APmRNA和蛋白的表达。PNS组CD2APmRNA表达与血清白蛋白(ALB)、SCr、三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)、补体C3、24 h尿蛋白定量和肾小球滤过率(eGFR)行相关性分析。结果 PNS组18例、对照组11例进入分析，两组性别和年龄差异无统计学意义。①PNS组肾组织CD2AP蛋白的表达较对照组降低，(1.302±0.885)vs(2.24±1.18),P<0.05，且病理表现为局灶节段性硬化(FSGS)的PNS患儿CD2AP蛋白表达最低。②PNS组肾组织CD2APmRNA的表达较对照组下调，(0.008 58±0.006 12)vs(0.019±0.012),P<0.05。 ③PNS组肾组织CD2APmRNA表达与血清TG(r=-0.527，P<0.05)、24 h尿蛋白定量(r=-0.602，P<0.01)呈负相关，与肾组织CD2AP的蛋白表达呈正相关(r=0.788，P<0.01)，而与血清Alb、TC、补体C3、GFR和SCr无显著相关性。结论 PNS患儿肾小球足细胞中CD2AP的蛋白和mRNA表达降低，特别是病理表现为FSGS的患儿，可能对足细胞病变的诊断有一定帮助。CD2AP的表达量可能与PNS临床指标相关。

CD2AP； 肾病综合征； 足细胞； 儿童

原发性肾病综合征(PNS)是儿童时期常见的肾小球疾病，其发病机制和蛋白尿形成原因仍不清楚，大量蛋白尿是肾病综合征(NS)的主要特点，由肾小球滤过膜对血浆蛋白的通透性增高所致，足细胞在维持肾小球结构和功能中起到了重要的作用[1]，其胞体、足突构成了肾小球滤过屏障的最外层，上皮细胞足突间的裂孔隔膜(slit diaphragm，SD)与蛋白尿产生相关，近年发现的CD2AP是SD结构的组成部分之一，其确切临床意义并不清楚。PNS患儿关于肾组织CD2AP表达的研究较少，且多为动物及细胞实验，邢燕等[2]在阿霉素肾病大鼠中发现 nephrin、CD2APmRNA和蛋白表达较正常对照组增高，史秀岩等[3]在成人NS患者研究中却出现相反的结果，可能是由于动物模型与人体NS的发病机制不同所致。本研究通过检测PNS患儿CD2AP在肾组织的表达，探讨其与肾小球足细胞损伤的相关性制，为儿童PNS的治疗提供理论基础。

1 方法

1.1 PNS组纳入和排除标准 ①2012年1月至2013年6月入住上海市儿童医院(我院)确诊为PNS的患儿，PNS符合2009年中华医学会儿科学分会肾脏学组制定的标准[4]；②行肾活检的病例。排除肾活检剩余组织较少或提取RNA量不足无法完成CD2AP表达检测的病例。

1.2 对照组 同期我院行泌尿系统肿瘤切除患儿为对照组，取远离肿瘤并病理确认为正常的肾组织。

1.3 知情同意和伦理 本研究获得我院医学伦理委员会批准。PNS组和对照组患儿父母被告知研究目的和意义，并签署知情同意书。

1.4 肾组织活检 肾组织石蜡切片行苏木精-伊红(HE)、PAS、PASM和Masson三色染色，光镜下观察肾组织病理改变；免疫病理采用冷冻切片直接免疫荧光标记；电镜组织经2.5%戊二醛液和锇酸4℃固定、乙醇梯度脱水、环氧树脂包埋、切片厚度60 nm、醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜(日立公司的H600型透射电子显微镜)下观察。

1.5CD2AP表达检测

1.5.1 肾组织CD2AP蛋白表达 肾组织4 μm厚石蜡切片，常规脱蜡，甲醇中用3% H2O2封闭内源性过氧化物酶30 min，微波抗原修复10 min，1%BSA室温封闭1 h。滴加一抗兔抗人CD2AP抗体(Santa Cruz，MA，1∶100)，4℃孵育过夜。PBS漂洗3次，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗(Pierce，美国)37℃孵育30 min。PBS漂洗3次，显微镜下DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固。用同等浓度的兔血清IgG(Pierce，美国)染色作为阴性对照。用Image-ProPlus 6.0图像分析系统进行分析，计数每例患儿切片中至少 3 个完整的肾小球视野摄像保存(每张切片在200倍光学显微镜下随机选取)，选取图片上具有染色调的区域(AOI)，CD2AP为胞浆着色，呈棕黄色或棕褐色。测定选定区域的面积和积分光密度(IOD)，计算平均吸光度(IOD/area)，为肾小球CD2AP蛋白表达量。

1.5.2 实时定量PCT检测(qPCR)检测CD2APmRNA表达 肾活检组织用Trizol法提取总RNA，取1 μg RNA进入反转录体系，合成cDNA，其后参照SYBR Green qPCR SuperMix反应试剂盒(Invitrogen公司)说明书进行qPCR，定量PCR仪为ABI PRISM®7500 Sequence Detection System。β-actin、CD2AP引物由上海锐金生物医药科技有限公司合成；β-actin引物序列：上游5′-ACTTAGTTGCGTT-ACACCCTTTCTTG-3′，下游5′-CCTTGCCACTTCCACTGTCG-TCA-3′ ；CD2AP引物序列：上游5′-CTAAATGGGAGAAGA-GGA-3′，下游5′-TAGGTGCTTATTCGTTGT-3′；以β-actin为内参，计算目的基因Ct值作为其相对表达水平。

1.6 实验室指标 截取病史中与PNS相关的实验室检查指标，包括血清白蛋白(ALB)、肌酐(SCr)、三酰甘油(TG)、胆固醇(TC)、24 h尿蛋白定量(UP)(采用日立7060全自动生化仪)；补体C3(采用德灵全自动分析仪)，并根据Schwatz公式计算出各患儿的肾小球滤过率(eGFR)。

2 结果

2.1 一般情况 PNS组纳入18例，男12例，女6例，年龄(6.3±3.7)岁，行肾活检时病程为(8.3±6.7)个月；微小病变(MCD)12例，局灶节段硬化(FSGS) 4例，系膜增生(MsPGN)2例；激素敏感14例(其中激素依赖10例)，激素耐药4例。对照组11例进入分析，男7例，女4例，年龄(6.6±3.1)岁。两组在性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 肾组织CD2AP蛋白表达 PNS组肾小球CD2AP的蛋白表达较对照组显著降低(0.008 58±0.006 12)vs(0.019±0.012),P=0.27;不同病理类型PNS患儿肾组织CD2AP蛋白表达如图1所示，FSGS、MCD和MsPGN患儿CD2AP蛋白表达分别为(0.002 4±0.000 9)、(0.011±0.006)和(0.008±0.001)，FSGS患儿CD2AP蛋白表达最低。激素敏感、激素耐药患儿肾组织CD2AP蛋白表达分别为(0.009 7±0.063)和(0.004 5±0.003 2)，激素敏感有高于激素耐药患儿的倾向。

qPCR结果显示，PNS组肾组织CD2APmRNA的相对表达量较对照组下降，(1.30±0.88)vs(2.24±1.18),P=0.20，FSGS、MCD和MsPGN患儿CD2APmRNA表达分别为(0.55±0.18)、(1.58±0.95)和(1.16±0.24)。激素敏感、激素耐药患儿CD2APmRNA表达分别为(1.44±0.95)和(0.82±0.35)。

图1 原发性肾病综合征组和对照组肾组织CD2AP免疫组织化学染色(×200)

Fig 1 The CD2AP immunohistochemistry findings of renal tissue in primary nephrotic syndrome and control groups(×200)

Notes A: Obvious expression on glomerular capillary loop and several podocytes in normal renal tissue; B: Decreased expression in MCD patients; C: Decreased expression and tablet-like deficit

2.3CD2APmRNA表达与实验室指标的相关性分析 表1显示，PNS组肾组织CD2APmRNA的相对表达量分别与血清TG(r=-0.527，P<0.05)、24 h尿蛋白定量(r=-0.602，P<0.01)呈负相关，与肾组织CD2AP的蛋白表达呈正相关(r=0.788，P<0.01)，而与血清ALB、TC、补体C3、GFR、SCr之间的相关性无统计学意义。

LaboatrayindexesValuerPAlb/g·L-123．9±9．70．4130．088TG/mmol·L-12．96±1．90-0．5270．024TC/mmol·L-110．26±4．62-0．3770．123Cr/μmol·L-139．7±8．1-0．1220．630GFR/mL·min-1·1．73m-2141．6±10．80．3230．191C3/g·L-11．19±0．31-0．03620．88724hprotein/mg·kg-1103．5±80．9-0．6020．008CD2APproteinexpression0．00858±0．006120．7880．0001

3 讨论

目前研究证实，足细胞损伤是导致大量蛋白尿以及肾小球硬化的原因[5,6]，而儿童PNS的病理类型大部分为MCD及FSGS等足细胞病变。足细胞主要通过SD发挥其滤过屏障的功能，足突收缩融合甚至足细胞缺失可导致形成SD结构的足突数量下降和功能异常，从而导致蛋白尿的产生，本文PNS组18例患儿足细胞病变为16例(MCD 12例，FSGS 4例)，电镜均有典型足细胞损伤表现，即弥漫足突融合、消失。

近年已发现nephrin、CD2AP、α-actinin-4、synaptopodin、TRPC6和Dystroglycans等众多足细胞相关蛋白分子与蛋白尿发生都有着密切关系[7～10]。CD2AP属于免疫球蛋白超家族，人CD2AP基因位于染色体6p12，编码区有1 920 bp，17个外显子，蛋白质序列有639个氨基酸，分子量为80 kD，其编码的CD2AP为足细胞SD蛋白，是一种跨膜蛋白，其N端与nephrin等骨架蛋白分子相连接，C端直接与足细胞足突骨架肌动蛋白丝相连，提示Nephrin、Podocin可能是通过CD2AP与足细胞细胞骨架发生联系，维持足细胞及SD的正常形态及功能。

本研究发现， PNS患儿CD2AP在肾组织中mRNA表达明显下调，在FSGS患儿中尤为明显，与成人NS的相关研究报道一致[3]，说明CD2AP表达减少和消失可能会导致足细胞及其SD的完整性受损，从而参与蛋白尿以及肾小球节段硬化的形成，但FSGS患儿的肾组织免疫组化仅表现为表达量下降，并未出现明显局部节段性表达浓度增高，可能由于本研究病例数较少、患儿发病年龄小等因素有关，值得进一步探讨。本研究还发现，PNS组肾组织CD2AP蛋白和mRNA水平呈一致性下降，提示其造成足细胞损伤机制可能并不仅是由于足细胞的结构性变化，可能导致信号传导通路异常，从而造成足细胞凋亡[11]。

正常情况下CD2AP分子均匀分布于足细胞的细胞核、细胞浆及细胞膜。本研究可见正常肾组织中CD2AP蛋白在肾小球毛细血管袢和个别足细胞上呈明显的阳性表达，而在PNS患儿肾小球中出现分布不均匀甚至呈片状缺失，表达水平明显降低(与mRNA水平一致)，推测CD2AP分布没有在SD上正确定位，足细胞之间以及其余细胞骨架之间的正常连接被打乱，致使SD结构与功能发生紊乱并失去屏障功能，最终导致蛋白尿的发生。而电镜中呈现MCD和FSGS等的典型足细胞病变(弥漫足突融合、消失)，也提示CD2AP低表达可能参与了足细胞病变为主的PNS发病。

有研究显示激素耐药NS及FSGS可能存在CD2AP基因突变[12,13]，本研究显示PNS患儿CD2AP在蛋白水平和mRNA水平上降低，提示在基因水平上也可能存在异常，本课题组在前期研究中[14]发现CD2AP基因的启动子有突变序列，但本文18例PNS患儿的CD2AP基因外显子检测却未发现突变(另文发表)，提示本文患儿CD2AP蛋白和mRNA水平的降低可能与基因转录等调控水平上异常有关。既往研究认为激素通过抗炎和免疫调节发挥抗蛋白尿效应[15]，晚近研究表明足细胞中存在糖皮质激素的功能受体，提示糖皮质激素可能直接作用于足细胞发挥效应，但具体机制未明，本文激素敏感患儿CD2AP蛋白和mRNA表达有高于激素耐药的倾向。

PNS的临床特点除了大量蛋白尿外，还有低蛋白血症、高脂血症(高胆固醇血症)和不同程度的水肿，是PNS的发生、缓解和复发的判断依据，也是足细胞受损后所产生的相应表现，本研究发现CD2APmRNA的表达与血清TG和24 h蛋白尿定量呈负相关，可能是足细胞损伤程度与大量蛋白尿相关，在此状态下CD2AP表达下调程度亦有不同，而目前认为血清TG的升高也与大量蛋白尿密切相关，但本研究例数较少，是否存在明确的相关性有待于扩大样本量进一步分析。

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(本文编辑：丁俊杰)

中国医师协会儿童重症医师分会成立大会暨第一次全国儿童重症医师大会征文通知

经中国医师协会会员部批准，中国医师协会儿童重症医师分会成立大会暨第一次全国儿童重症医师大会定于2015年4月16～18日在北京召开。本次会议内容如下：①中国医师协会儿童重症医师分会成立大会仪式。宣布：中国医师协会《关于同意中国医师协会儿童重症医师分会成立的批复》、中国医师协会儿童重症医师分会人员组成及颁发聘书。②以“新起点、新使命” 为主题，就中国儿童重症医学科(PCCM)规范建设和科学技术等主题，进行专题报告、大会发言、分会场交流和热点问题讨论。

本文会议征文要求如下：①儿童重症医学科规范建设和科学技术相关的论文，且未在全国性学术会议或刊物上发表；②来稿请按照文题、作者姓名、单位、通讯地址、邮编、联系电话及E-mail、摘要和正文顺序撰写，其中摘要要求500～800字，包括目的、方法、结果和结论4要素；③本次会议不接收纸质投稿，请将稿件投送至cpia2014@163.com；④截稿日期：2015年3月15日。

本次会议联系方式：联系人：洪小杨(手机13311057633)，张倩(手机1860128286)，联系电话：010-66721033，传真：010-66721033。

Preliminary discussion on the correlation between podocytes injury and CD2AP expression in children with primary nephrotic syndrome

HAOSheng,WUYing,KANGYu-lin,CHENYong-qi,HUANGWen-yan,HEWei-xun,ZHUGuang-hua(DepartmentofNephrology,ShanghaiChildren′sHospital,Children′sHospitalofShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200040,China)

ZHU Guang-hua，E-mail: ghzhu301@aliyun.com

ObjectiveTo observe theCD2APexpression in renal tissue of children with primary nephrotic syndrome(PNS), and to discuss the association between the expression ofCD2APand podocytes injury．MethodsChildren with PNS after renal biopsy in Shanghai Children′s Hospital from Jan. 2012 to Jun. 2013 were enrolled as PNS group, patients with renal tumor undergone nephrectomy were recruited as control group. Renal pathological change was observed by conventional optical microscopes. Structure of podocyte was observed by electron microscopy. The renalCD2APmRNA and protein were examined by quantitive real time PCR and immunohistochemistry. Then serum albumin(Alb),creatinine(Cr),complement 3(C3),triglyeride(TG),cholesterol(TC),glomerular filtration rate(GFR)and 24-hours proteinuria were detected, simultaneously the relationship between these index and theCD2APexpression was analyzed.ResultsEighteen patients were enrolled as PNS group and 11 patients were enrolled as control group. ①Compared to the controls, the expression ofCD2APmRNA decreased significantly in patients with PNS(0.008 58±0.006 12vs0.019±0.012,P<0.05). ②Compared to the control group, protein expression decreased significantly in PNS group, (1.302±0.885)vs(2.24±1.18),P<0.05, and children with PNS were the lowest. ③In PNS group, there was moderate correlation betweenCD2APmRNA relative expression and TG(r=-0.527，P<0.05), 24 h proteinuria(r=-0.602，P<0.01), there was strong positive correlation betweenCD2APmRNA and protein expressions (r=0.788,P<0.01). The relationship betweenCD2APrelative expression and those index such as complement C3, GFR, Cr and TC had no statistic significance. ConclusionThe expression ofCD2APin podocyte of PNS cases decreased significantly, especially in those with FSGS. And this change may be correlated with clinical indexes of patients with PNS.

CD2AP; Nephrotic syndrome; Podocyte; Children

上海市卫生局级青年课题：2009Y048;上海市卫生局级课题：2009094

上海市儿童医院，上海交通大学附属儿童医院，肾脏风湿科 上海，200040

朱光华，E-mail:ghzhu301@aliyun.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2015.01.013

2014-09-20

2014-12-02)