迎接高通量测序技术诊断儿童遗传性疾病的新时代

2015-04-21夏凡,周文浩,王慧君

中国循证儿科杂志 2015年1期

·专家对谈录·

夏凡教授周文浩教授王慧君副研究员

周文浩教授非常荣幸能邀请到美国贝勒医学院夏凡教授来复旦大学附属儿科医院讲学，并就分子遗传诊断中心的工作给予非常具体的指导。复旦大学附属儿科医院分子诊断实验室已经开展100余项基因检测项目，应用Sanger测序、aCGH和MLPA等技术，建立了常见单基因遗传病的筛查和诊断平台，二代测序检测项目也初步展开。全外显子组测序(WES)技术，为寻找疾病的致病基因、易感基因等研究，提供了一种全新的研究方法。Science将WES评为“2010年世界十大科技进展”之一。

夏凡教授外显子组(exome)即一个个体的基因组DNA上所有蛋白质编码序列(外显子)的总和。人类外显子组序列仅占人类整个基因组序列的1%，约为30 Mb，包括约18万个外显子，估计85%的人类致病突变都位于这1%的蛋白质编码序列上。

从近5年采用WES用于临床诊断的文献可以看出其应用的趋势。2009年，HowardHughesMedicalInstitute报道了第1篇WES用于临床诊断的文章；2010年，NatureGenetics发表了3个不同的家系应用WES进行临床检测的文章。2013年美国贝勒医学院对250例先证者行WES临床检测，阳性率在25%，发表在NewEnglandJournalofMedicine。2014年，我们将病例进一步扩大到了2 000例，发表在JAMA上。估计在2015年三、四季度会出现全基因组序列分析(WGS)在临床广泛推广的报道。

从已发表的文献来看，采用WES进行临床诊断的病例主要集中在儿科，比如发表在JAMA上的2 000例先证者，88%为儿科患者，平均年龄仅6岁。

周文浩教授 WES主要适用于儿科什么样的疾病？

夏凡教授主要送检的是神经系统、发育相关的疾病。当这些疾病通过常规筛查流程不能得到诊断时，医生会考虑送检WES。随着WES检测价格的降低和分析时间的缩短，WES有取代所有筛查性检测手段的趋势。对于临床不能诊断的、需要快速明确病因的严重疾病，WES可以替代筛查检测。美国贝勒医学院附属德克萨斯医院新生儿科，在进行遗传相关因素的探究中，多数直接送检WES，争取在最短的时间内找到病因。对于可以治疗的疾病，早期诊断对于预后的改善具有至关重要的意义。

周文浩教授但针对新生儿人群进行WES检测的研究依然比较少。

夏凡教授是的，美国贝勒医学院的送检人群中，新生儿也是比较少的。一方面，神经系统、发育相关疾病与遗传紧密相关，临床医生容易认可和接受WES。另一方面，新生儿期的某些疾病(代谢性疾病)进展迅速，需要依靠快速出具报告的检测方法，WES初期的确不能快速出具报告。随着数据分析水平的提高、流程的完善，更能满足临床快速出具报告的需要，新生儿的送检病例会迅速增加。

美国新生儿出生缺陷发生率约3%，既往仅依靠临床表现、常规辅助检查，约1%可以得到诊断。如果采用了WES、WGS及CGH检测后，诊断率可以提升至2%～2.5%，WES检测在新生儿疾病中还有巨大的潜力。

周文浩教授我们课题组前期针对新生儿多发畸形，进行了染色体水平检测：从目的片段拷贝数变异(即自行设计的多发畸形筛查MLPA试剂盒)到全基因组拷贝数变异检测，总体阳性率约为25%。后续又对没有检测到拷贝数变异的病例，选择性地进行了候选基因panel、WES检测。对这种检测策略可以给出哪些建议。

夏凡教授目前针对出生缺陷，可以有结构畸形及功能缺陷(肌肉松软、惊厥等)。会有部分和染色体微重复/微缺失相关。从检测成本和数据分析周期而言，也可以将拷贝数变异检测作为第一步的检测方法，这是合理的筛选流程。其实在美国贝勒医学院，所有送检WES的样本，都会进行分辨率不是很高的SNP芯片检测，可以比较全面的了解送检样本的分子遗传学信息。①通过与WES检测到的SNP分型的比较来确定样本的一致性，②可以检测到一些比较大的染色体微重复/微缺失。

王慧君副研究员 WES能不能在检测外显子组序列的同时也进行拷贝数变异的分析？

夏凡教授在美国贝勒医学院进行的WES 检测，平均覆盖倍数在100×。由于WES技术本身的特点，必然存在一定的偏向性扩增。如果需要非常准确的检测染色体微重复/微缺失，可能需要达到1 000×，成本将大幅度提升，性价比不高。WGS是可以将染色体微重复/微缺失和测序分析统一起来的技术。针对需要在短期内快速得到更全面的信息，WGS可能是更好的选择，随着技术的不断进步，价格的不断降低，WGS必然会得到更广泛的推广。

单基因序列异常在分子遗传学病因中占有很大比例，某些神经系统功能缺陷，如单纯惊厥、肌肉松软等疾病，进行WES检测就是很好的选择，阳性率可以达到30%左右。

王慧君副研究员复旦大学附属儿科医院分子诊断实验室针对消化道结构畸形设计的Ion Torrent PGM平台上6个基因的panel，MiSeq平台针对缺氧耐受相关、惊厥相关目的基因panel和WES检测分析。高通量测序对上述不同检测方法分别的适应类型是什么？

夏凡教授具有典型临床表型、候选基因单一的病例，可以直接进行该候选基因Sanger检测；对于某个表型，候选基因数<20个，可采用panel进行检测；当候选基因数>200个，从检测成本而言就可以直接进行WES检测；候选基因在20～200可根据情况权衡选择。

王慧君副研究员目前国际上WES检测及数据分析的领跑者有哪些单位？

夏凡教授目前有美国的Genome Center at White Head/MIT、美国华盛顿大学基因中心，美国贝勒医学院基因中心，英国的Sanger中心，中国的华大基因研究中心。其中美国贝勒医学院和临床的联系最紧密，最先将基因组水平测序应用于临床。目前美国主要数据分析中心有GeneDex、UCLA(偏重科研，强调病例的选择)和Ambry Genetics等。数据分析常规所需要的时间是6周，最理想状态下快速分析为2～3周。

周文浩教授 WES检测的技术已经非常成熟，决定并影响WES在临床应用推广的因素包括：临床医生对于该技术的认识、检测的费用、数据分析方法和数据分析所需时间，上述4个因素中WES的数据分析可能最制约临床推广应用。

夏凡教授仅就WES检测技术而言，已经比较成熟，正常情况下检测数据需3～4周出报告。高通量测序的数据分析能力较前也有了很大的提高，美国贝勒医学院在WES应用于临床的前半年，1例患者需要40～50 h，也就是1个人1周完成1个病例。半年后总结并形成了系统的分析流程，分析时间缩减到了1例患者需2 h。目前美国贝勒医学院比较熟练的基因组分析员，分析1例患者约需1 h。

在数据分析中，前半部分属于生物信息分析，在各个基因组检测中心都做得比较好，多可以自动化形成分析流程，可以准确地过滤变异；后半部分属于医疗信息分析，需要从检测到的变异中筛选出可能的致病突变，这个过程非常依赖医学相关的背景。其实现在缺乏的是能够将生物信息分析和医疗信息分析进行协调，并有能力从各个数据库遴选出有用的信息，在不同的分析阶段，进行不同程度的侧重注释。这是目前影响WES数据分析流程的瓶颈。

周文浩教授在新生儿多发畸形WES的数据分析中，检测到的可能致病突变所在基因，其引起的疾病与患儿表型并不完全一致，您对“genotype first”还是“phenotype first”怎么看？

夏凡教授目前对人类基因组还有太多的不认识，分子遗传学还有太多待解的谜题。现在之所以被困扰在“genotype first”还是“phenotype first”，其实主要还是因为对其不了解。被定义的单基因疾病，很多有非常高的异质性，即便是相同的突变位点、即便在一个家庭里，相同疾病的表型都不一致。是什么原因所致？这些疾病真的都是单基因疾病吗？所幸的是，现在有这么多组学水平的技术手段：基因组学、甲基化组学、转录组学、蛋白组学等，能以一种前所未有的速度来解读人类遗传物质。随着研究的深入，可能会颠覆很多现在认为正确的观念，也一定会解决现在这些疑问。

新生儿多发畸形WES的判读是困难的，一是新生儿很多表型还没有出现，或者并不典型，二是一部分新生儿多发畸形由于病情严重而不能存活，致使表型没有得到诊断，不能被统计到常见表型中。2014年美国贝勒医学院发表在JAMA上的文章，患者平均检测年龄是6岁，随着年龄的增长表型会更加明显。但是，恰恰新生儿多发畸形最需要得到早诊断、早干预。

周文浩教授目前国际上各个基因组检测中心，阳性率25%～30%，余下的70%～75%有什么可做的吗？

夏凡教授 WES相当于一个筛选的方法，在人类全部22 000个基因中，目前已经认识的致病基因有3 000～5 000个，还有很多致病基因并不认识。2013年美国贝勒医学院对250例先证者进行WES临床检测，阳性率为25%，现在诊断率已经上升至28%，剩余的70%～75%的病例继续采用模式生物的结果等做进一步分析，可能还会发现一些候选基因有研究价值。

4年前，美国国立卫生研究院(NIH)在孟德尔遗传学中心开始对家系进行WES检测。最近，NIH又在进行确诊疾病网项目，希望能在罕见疾病的病因研究中有所发现。

此外，目前所采用的分析方法，主要关注的是单基因疾病。那么，还有双基因、三基因甚至多基因疾病，如GJB2/GJB6，当2个基因都含有杂合致病突变时才会致病。各个研究机构正在进行双基因乃至多基因模式的研究，有所突破是就是世界领先的水平。

致谢感谢复旦大学附属儿科医院杨琳博士承担本文的录音整理工作。

(本文编辑：张崇凡)