奶牛气单胞菌的分离和鉴定

谭 萍，艾东旭，李 玮 ，孙 菲，宋书婷

（1.阿克苏地区畜禽改良站，新疆 阿克苏843000；2 塔里木大学生命科学学院，新疆 阿拉尔843300；3.塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔843300）

气单胞菌属是革兰氏阴性发酵细菌之一，原隶于弧菌科，现已单独成立为气单胞菌科。本属细菌是常见的腐物寄生菌，普遍存在于水生环境中，是多种动物的重要病原菌[1]，可从水源、土壤以及人的粪便中分离，本属细菌有的种可引起人类腹泻等多种感染。气单胞菌属已成为引人注目的人兽共患病的新病原[2]。迄今为止已相继确认7 种气单胞菌与人类疾病有关[3]。

目前，我国已建立了较为系统的检验方法，但尚无一种特异性强的初筛鉴定培养基，直接影响气单胞菌的检出率并延长了确认鉴定时间[4]。国内外学者对其进行了大量研究，现普遍认为该菌的致病性与其产生的毒立因子密切相关。气单胞菌的致病性是由多种毒力因子共同作用的，目前研究较多且较深入的是嗜水气单胞菌，其毒力因子主要包括胞外毒素、胞外酶类和點附因子等。这些毒力因子以不同的作用方式及机制导致宿主发病[5]。

气单胞菌通过食物传播的方式有，受污染的水污染食物以及含该菌的动物粪便在去肠过程中污染肉尸及副产品显性或潜隐态带菌的食品加工人员污染的食品。食入在食物中已存在的气单胞菌毒素亦可致病[6]。由于气单胞菌菌种在MacC、SS 平板上菌落浑浊而不透明，不能进行氧化酶试验，常被认为是正常菌群而被忽视，造成诊断不明，迁延不愈，甚至存在病原菌散在流行[7]。本菌生物学特性于大肠杆菌相似，极易混淆，如果不作氧化酶试验容易被漏检[8]。

2013 年，新疆疆南牧业有限公司规模化奶牛场从内地引进奶牛到场后，先后有10 余头奶牛死亡，主要临床症状以体温升高、咳嗽、腹泻等为特征。病理解剖变化主要为肺组织纤维素性渗出、散在大小不一的脓肿结节，与胸膜粘连。在解剖过程中发现有明显的急性腹泻炎症及各浆膜粘膜出血，以急性肠炎病变为主要特征，且发病率和死亡率都高于以往。为确定引起犊牛发病死亡原因，避免疫情扩大并有效地控制该病的传播。本研究旨在确定发病原因，为建立本病有效的诊断方法及免疫防治提供理论与技术支撑。

1 实验材料与方法

1.1 病料

新疆南疆某奶牛场发病及死亡奶牛的病料：病牛肠液。

1.2 材料

载玻片，接种棒，酒精灯，吸水纸，蒸馏水，结晶紫，95%酒精，碘化钾，碘片，沙黄，蛋白胨，酵母粉，石碳酸，羊血营养琼脂，甲基红，吲哚，氯化钠，葡萄糖，甘露醇，蔗糖，乳糖，3%H2O2，脲酶，显微镜，平皿。

1.3 试验试剂配制参照《伯杰细菌鉴定手册》[9]和《兽医微生物学实验指导》[10]以及《常见细菌系统鉴定手册》[11]配制使用及储存。

1.4 方法

1.4.1 生物学特性研究

1.4.1.1 细菌形态鲜血琼脂培养基上培养24h，在血琼脂上形成灰白、光滑、湿润、凸起直径约2mm 的菌落，多数菌株有β 溶血环。

1.4.1.2 革兰氏染色法

挑取血琼脂培养基上单菌落进行革兰氏染色，具体操作方法参照《兽医微生物学实验指导》[10]操作进行。

1.4.2 生化鉴定试验

1.4.2.1 糖酵解试验

原理：细菌分解糖的能力与细菌是否含有分解某种糖的酶密切相关，是受遗传基因所决定的，是细菌重要的表型特征，有助于鉴定细菌，含糖培养基中加入指示剂，若细菌分解糖则产酸或产酸产气，使培养基颜色改变，从而判断细菌是否分解糖或其他碳水化合物。

操作：将细菌的纯培养物分别接种到葡萄糖发酵，乳糖发酵，甘露糖发酵，蔗糖发酵培养基中。糖类试验37℃培养24h，观察结果并记录。如果接种进去的细菌可发酵某种糖或醇，则可以产酸，使培养基由紫色变成黄色（培养基内指示剂溴甲酚紫pH7.0 紫色pH5.4 黄色），如果不发酵，则保持紫色；如果发酵的同时又产生气体，则在发酵管顶部积有气泡。

1.4.2.2 脲酶活性检测

原理：细菌分解尿素产生两分子氮，使培养基pH 升高，指示剂酚红显示红色，即证明细菌有脲酶。

操作：将分离菌接种到尿素琼脂斜面，不要穿刺到底，下部留作对照。置37℃培养，于1～6h 检查(有些菌分解尿素很快)，有时需培养24h～6d（有些菌则缓慢作用尿素）。阳性反应，琼脂斜面由粉红色到紫红色。

1.4.2.3 甲基红(MR)试验/VP 试验

原理：细菌分解培养基中的葡萄糖产酸，当产酸量大，使培养基的pH 降到4.5 以下时加入甲基红指示剂而变红。

操作：取细菌的24h 纯培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水溶液中，置37℃培养48～72h 取出后加甲基红3～5 滴，凡培养液为红色者为阳性，橙色为可疑，黄色为阴性。

1.4.2.4 吲哚试验

原理：有些细菌能分解蛋白质中的色氨酸产生吲哚，吲哚与对二氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而成红色。

操作：以接种环将待检菌新鲜斜面培养物接种于邓氏蛋白胨水溶液中置37℃培养24～48h；于培养液中加入戊醇或二甲苯2～3mL 摇匀静置片刻后，沿试管壁加入欧氏试剂或柯氏试剂2mL。

1.4.2.5 触酶试验

原理：本试验是检测细菌有无触媒的存在。过氧化氢的形成看作是糖需氧分解的氧化终末产物，因为H2O2的存在对细菌是有毒性的，细菌产生酶将其分解，这些酶为触酶（过氧化氢酶）和过氧化物酶。

操作：用接种环将菌落放于载玻片中央，加一滴3%H2O2于菌落上，立即观察有无气泡出现，也可在菌落和H2O2混合物之上放一张盖玻片，可帮助检出轻度反应，还可降低细胞的气溶胶颗粒的形成。或直接将3%H2O2加到培养琼脂斜面或平板上直接观察有无气泡出现（血琼脂平板除外）。

1.4.2.6 药敏试验

原理：各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床，对控制细菌性传染病的流行至关重要。

操作：取菌种，用灭菌接种环致密划线于琼脂平板表面（可重复来回划线），或用“十”字形划线法。用无菌镊子将各种抗菌药物圆纸片，分别贴于培养基表面，各片距离要相等。37℃培养24h 观察结果。

1.4.3 16S rDNA 测序

为进一步确定该菌，送上海生工对该疑似菌的16s rDNA进行测序。

操作：对纯化的疑似菌过夜培养，做成甘油菌，送上海生工测序。

2 实验结果

2.1 生物学特性研究结果

2.1.1 鲜血琼脂培养基培养结果

鲜血琼脂培养基上培养24h，在血琼脂上形成灰白、光滑、湿润、凸起直径约2mm 的菌落，多数菌株有β 溶血环，如图1所示。

2.1.2 革兰氏染色结果

革兰氏染色紫色呈阴性蓝色呈阳性，奶牛革兰氏阴性短杆菌，如图2 所示。

图1 羊血平板上奶牛 气单胞菌

图2 奶牛气单胞菌革兰氏染色镜检图片

2.2 生化鉴定结果

2.2.1 葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖发酵试验

如果接种进去的细菌可发酵某种糖或醇，则可以产酸，使培养基由紫色变成黄色（培养基内指示剂溴甲酚紫pH7.0 紫色pH5.4 黄色），如果不发酵，则保持紫色。气单胞菌可以与葡萄糖，甘露醇，蔗糖乳糖有反应，结果如图3 所示。

图3 乳糖、葡萄糖、甘露醇、蔗糖

2.2.2 脲酶实验

琼脂斜面由粉红色到紫红色，呈阳性反应。试验证明气单胞菌菌脲酶试验结果呈阴性，结果如图4、5 所示。

图4 脲酶试验前

图5 脲酶试验后

2.2.3 甲基红(MR)/V-P 试验

甲基红指示剂变为红色者为阳性，橙色为可疑，无变化为阴性。气单胞菌试验结果为阴性，结果如图6 所示。

V-P 培养液呈红色者为阳性；不变色者为阴性。气单胞菌对V-P 培养液反应呈阳性，结果如图7 所示。

图6 甲基红试验（左为对照）

图7 V-P 试验（左边为对照）

2.2.4 吲哚试验

有些细菌能分解蛋白质中的色氨酸产生吲哚，吲哚与对二氨基苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而成红色，则反应为阳性；若不能则为阴性。实验结果气单胞菌菌不能分解蛋白质中的色氨酸产生吲哚，试验为阴性，如图8 所示。

图8 试验后、试验前

2.2.5 触酶试验

用接种环将菌落放于载玻片中央，加一滴3%H2O2于菌落上，菌落和H2O2混合物之上放一张盖玻片，若出现气泡呈阳性没有气泡呈阴性。气单胞菌产生酶将H2O2分解产生气泡，结果呈阳性，如图9 所示。

图9 触酶试验结果

2.2.6 药敏试验

药物浓度4 万个单位。1 号庆大霉素，2 号青霉素，3 号头孢噻诺，4 号氟哌酸，药物效果强度排序1＞4＞3＞2。

图10 药敏实验结果

2.2.7 生理生化鉴定理论结果与实际结果对比

表1 气单胞菌生化试验结果

根据东秀珠等编著的《常见细菌系统鉴定手册》[11]，细菌染色和生化鉴定结果表明：由表1 怀疑此次分离的细菌为气单胞菌。为进一步确定该菌是否为气单胞菌，送上海生工对该疑似菌的16S rDNA 进行测序。

2.3 16S rDNA 测序及对比结果

2.3.1 测序结果

2.3.2 分析结果

根据拼接测序及分析结果显示，相似度99%，基本可确定此次分离的细菌为气单胞菌，可以断定这些奶牛发病死亡的主要原因是感染了气单胞菌。

3 结论

根据对奶牛气单胞菌的分离及鉴定，经形态学观察，生理生化试验相结合的方法进行菌株的筛选和鉴定，怀疑其为气单胞菌。及时、准确的分离鉴定出病原菌进行生化特性鉴定，了解本菌的致病因素的流行情况，对控制本菌致病的发生具有极其重要的意义。加强对气单胞菌属败血症的认识，为临床估计病情及治疗选择提供依据。本研究通过鲜血琼脂培养基，生化鉴定实验，革兰氏染色等实验以及16s rDNA 确定此菌是气单胞菌。

4 讨论

目前，气单胞菌是近年来不断引起医学界注意的革兰氏阴性发酵细菌之一。在我国的发生仍然呈上升的趋势，对养牛业及水产业的发展带来的危害较大。本病的病原菌气单胞菌，菌株种类多又复杂，具有地方特异性。气单胞菌全面的生化反应一直没有一个公认的结果，这与气单胞菌的分类有密切关系。多年来气单胞菌的分类一直处于不断变化之中，特别是在菌种的命名方面仍不十分明确。目前一般将气单胞菌分成四个种，即亲水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、寡源气单胞菌和杀蛙气单胞菌。它们又分别被包括在两个群内,前三个种为嗜温有动力群，后一个种单独为嗜冷无动力群。通常认为嗜冷无动力群菌对人类没有致病性。

气单胞菌的主要病变为急性肠胃炎，败血症和菌血症，具有很强传染性，是新的人兽共患病病原。对畜牧业和人体健康产生极大的危害。本次实验是从牛的肺脏中取材并通过生化实验以及16s rDNA 测序拼接对比结果最终确定为气单胞菌。但该菌对牛内脏器官产生的具体病理变化和牛感染后的临床症状并不清楚，接下来我们将对以上两点进行进一步研究。

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