一例仔猪病毒性腹泻混合感染的诊断报告

徐春芳

（青海省海东市畜牧兽医工作站，810600）

随着我国养猪产业的日益规模化，猪腹泻性传染病的流行日益增多，尤其自2010年下半年以来，我国养猪密集地区由南方至北方相继暴发了以新生仔猪高发病率、高死亡率、现有疫苗与药物防治效果均不理想为主要特征的腹泻性疫病[1.2]，给国内养猪业带来了巨大的经济损失。导致生猪腹泻性传染病的病因极其复杂，主要有病毒性腹泻、细菌性腹泻、寄生虫性腹泻以及营养性腹泻等[3]，且常常混合感染，混合感染的伤害更为严重，通常具有更高的致病性和死亡率[4]，较难控制。本研究对青海省某养殖场腹泻仔猪进行临床诊断和实验室PCR确诊，最后确诊为由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diar rhea virus，PEDV）、 猪 传 染 性 胃 肠 炎 病 毒（Transmissible gast roenteritis virus，TGEV）、猪轮状病毒（rotavirus，RV）3种病毒混合感染所致，为该养殖场和该地区猪腹泻性传染病的综合防控提供了基本资料信息。现将诊断过程报告如下：

1 临床诊断

1.1发病情况 2013年11月，青海省某养猪场哺乳仔猪发生严重腹泻，发病率在80%以上，死亡率约为70%。该场未进行猪病毒性腹泻疫苗的免疫接种，发病后曾用链霉素、青霉素、磺胺类等抗生素类药物进行治疗，无任何效果。

1.2临床症状 临床表现为精神萎顿，厌食、呕吐、排水样粪便，最后因机体脱水、消瘦、衰竭而死亡。

1.3病理变化 对病死猪进行剖检，可见胃黏膜有出血点，胃内充满凝乳块，肠管膨胀扩张，肠壁变薄，呈半透明状，肠内容物呈黄色泡沫状，肠淋巴结充血、水肿，肾脏变性。

1.4临床诊断结果 通过以上发病特点、临床症状、病理变化及流行病学资料初步判定该场为猪病毒性腹泻，但究竟由哪种或哪几种病毒感染引起，还无法确定。

2 实验室诊断

2.1病料的采集与样品处理 尽量无菌采集病死猪小肠、肠黏膜及淋巴结，低温、迅速运输至实验室。将采集的组织病料与5倍体积灭菌生理盐水充分混合、碾磨、匀浆，反复冻融3次，12000r/min离心10min，取上清液，-20℃保存备用。

2.2试验所需主要试剂Trizol、DL 2000 Marker购自生工生物工程（上海）股份有限公司；一步法RT-PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；氯仿、异丙醇、无水乙醇均为国产分析纯试剂。

2.3设计合成引物 根据参考文献[5]设计针对PEDV、TGEV、RV的特异性检测引物，详见表1，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1引物信息表

2.4RNA的提取 取组织样品上清液200μL，加Trizol试剂600μL充分混合后室温静止5min，加氯仿200μL充分混合后室温静止5min，12000 r/min离心10 min，取上清液加入等量异丙醇，轻轻混合均匀，室温静止10 min，12000r/min离心10 min，弃上清液，加入1mL70%无水乙醇，12000r/min离心5 min，弃上清液，沉淀溶解于20μL无Rnase水中，即得

2.5RT-PCR扩增 以提取的RNA为模板，进行RT-PCR扩增。RT-PCR扩增体系为25μL，含2×Buf fer 12.5μL、酶1μL、上下游引物各0.5μL、RNA 5μL、水5.5μL。RT-PCR扩增程序为：50℃1h；94℃4min；94℃45s，55℃45s，72℃45s，30个循环；72℃10min。2.6RT-PCR扩增产物的检测 RT-PCR扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测分析，结果如图1所示，PEDV、TGEV、RV均为阳性。

3 诊断结论

经临床诊断确定为仔猪病毒性腹泻，经实验室诊断确定为由PEDV、TGEV、RV 3种病毒混合感染所致，但究竟是3种病毒中的1种病毒在致病过程中起到了决定性作用，还是3种病毒协同起到了致病作用，有待进一步研究。

4 讨论

近年来，因猪病毒性腹泻引起的仔猪死亡日益增多，猪病毒性腹泻的危害日益严重。郭旋等[1]对2011～2012年广西11个城市232份病料进行PEDV、TGEV、RV的流行病学调查，PEDV、RV、TGEV的阳性率分别为37.50%、0.03%、0%，刘云波等[2]对2011～2012年国内13个省市的猪腹泻样品进行检测，TGEV、PEDV、RV阳性率分别为2.65%、24.49%、3.20%。魏海芳等[6]对青海省60份腹泻临床病料进行PEDV、TGEV、RV的检测与分析，PEDV、RV和TGEV的阳性率分别为76.7%、51.7%和30.0%，PEDV/RV、PEDV/TGEV、PEDV/RV/TGEV的混感率分别为23.33%、8.33%、51.67%，不存在RV/TGEV混感型。猪病毒性腹泻病毒在我国已具有非常高的感染率，呈全国性散发性流行，其中以PEDV的感染最为突出，感染率最高，且PEDV与RV、TGEV的混合感染比较普遍，给临床诊断和预防控制增加了难度，这就要求临床兽医在确诊PEDV感染的同时，还应重点考虑是否存在TGEV或RV的混合感染。

猪病毒性腹泻对仔猪的危害严重，病死率非常高，猪即使耐过存活，康复后仍然生长缓慢，降低养殖经济效益。而目前，PEDV与RV、TGEV的混合感染使仔猪病毒性腹泻更加难以控制，本病例实验室诊断结果为PEDV、TGEV、RV 3种病毒混合感染，这在仔猪病毒性腹泻病例中具有十分典型的代表性。因PCR分子生物学诊断技术具有敏感、特异、操作简单等优点，且能够检测到特定病原体特定的核苷酸序列，具有常规诊断方法无法比拟的准确性，故本病例采用PCR技术作为确诊的工具，增加了诊断结果的可靠性。但本病例究竟是由3种病毒中的1种病毒所致，还是3种病毒协同起到了致病作用，有待病毒分离和致病性试验等更进一步研究。

[1]郭旋,陈静,刘欢,等.广西仔猪腹泻病毒病原流行病学调查[J].南方农业学报,2013,44(1):155-160.

[2]刘云波,赵洪翠,王志成,等.猪病毒性腹泻分子流行病学调查[J].中国畜牧兽医,2013,40(2):204-207.

[3]程忠军.导致猪腹泻的常见原因与应对措施[J].安徽农学通报,2013,19(13):137-138.

[4]SongDS,KangBK,OhJS,etal.Mul tiplexreversetranscription-PCR for rapid di f ferential detection of porcine epidemic diar rhea virus,transmissible gastroenteritis virus, and porcine group A rotavirus[J].JVet Diagn Invest,2006,18(3):278-281.

[5]张坤,何启盖.猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J].畜牧兽医学报,2010,41(8):1001-1005.

[6]魏海芳,王鸿忠.青海省部分地区PEDV、TGEV和RV感染情况调查与分析[J].动物医学进展,2013,34(9):133-136.