16S rRNA 基因序列法鉴定幽门螺杆菌细菌种属

金恩鸿 朴諄娘 金东春 鞠重基

（1 延边大学附属医院；2 韩国朝鲜大学 口腔大学； 3 延边大学农学院； * 韩国朝鲜大学 口腔大学）

1 主要试剂和材料

主要菌株与试剂：

①.菌株：H pylori(菌株，由延边大学附属医院，志愿者同意后4病例中采样提供)；

②.实验试剂材:Columbia agar base(Gelix Ventech Bio Korea)；Brucel la broth （Becton Dickinson and Company Sparks.USA）；B多粘霉素B(Solar Bio公司)；PCR反应引物：16S RNA（27F:AGAGTT TGATCMTGGCTCAG；1492R：TACGGYTACCTT GTTACG ACT T）：PCR试剂盒：自制快速尿素酶液.

③.实验仪器：PCR基因扩增仪（Bio.Rad，美国）；RS-232紫外分光光度计Eppendor f公司，德国；NU一4950E三气培养箱：（NUAIRE公司，美国）.

2 实验方法

2.1采样

胃粘膜标本的采集：延边大学附属医院胃镜室里取样，确诊感染幽门螺杆菌的未任何药物治疗患者 经志愿者同意采样的情况下，在纤维内镜检查的同时用活检钳在距幽门口的胃感染窦部3、6、9、12点处钳取4份胃粘膜组织后涂布哥伦比亚培养基(含幽门螺杆菌添加剂)上，置密封罐中加入微需氧产气袋(5%O2、10%C02、80%N2、5%H2)保管，移放已调好37℃含(5%O2、10%C02、80%N2、5%H2)，湿度为80%厌氧细菌培养箱中培养5天.

2.2培养

在37℃细菌培养箱里培养24-48小时。培养出来的菌落，按照菌落模样、大小、颜色等逐一分类.各取4份涂抹在哥伦比亚培养基(含幽门螺杆菌添加剂)上，调好37℃含(5%O2、10%C02、80%N2、5%H2)湿度为80%厌氧细菌培养箱中培养5天.从各个营养琼脂平板上取一个单独的菌落，放入3ml营养肉汤（Nut rient broth），在37℃细菌培养箱里培养3天.

2.3分离

利用paper point采培养皿上的细菌，放在1 ml的1X PBS缓冲溶液移置在厌氧培养室里1000倍稀释之后，均匀涂在含哥伦比亚琼脂的固体培养基里（Columbia agar base or brain heart infusion)+4%horse blood+抗生素［(Hel icobacter pylori selective supplement,SR147E,Oxoid)］、Brucel la broth 28g+Agar 15g+Skir row′s supplement 2ml/l iter+5%horse serum、Skirrow′s supplement、8mg的多粘菌素B加250mg的万古霉素 和125mg的甲氧苄氨嘧啶、Brucel la agar+Fungi zone 2ml+5%horse serum）.

在37℃(5%O2、10%C02、80%N2、5%H2)混合气体的培养箱里培养5天.观察5天，培养基上挑出针尖样、半透明的、散在的菌落用消毒后的接种环刮取菌落，将其接种到pet ri dishi(90╳15nm)平皿上37℃(5%O2、10%C02、80%N2、5%H2)培养4天.

3 鉴定

3.1幽门螺杆菌的快速尿素酶试验：

自制快速尿素酶液(取尿素20g,加二重蒸馏水200ml,过滤后加入0.4%酚红8ml)配成尿素酚溶液.eppendor f f tube管加入300ul尿素酚和150ul幽门螺杆菌培养液混匀后放置3分钟后观察颜色变化.颜色变为红色为阳性,不变色者为阴性。

3.2分子生物学方法鉴定

3.2.1细菌基因组DNA提取：

哥伦比亚琼脂的固体培养基里培养出来的菌落，放在TH broth里细菌培养液，使用G-spin Gemonic DNA Extraction Kit(iNtRON Inc.,Seoul,Korea)提取质粒DNA。操作如下：把1.5ml细菌培养液放到eppendor f f tube管12000 rpm离心1分钟，生成细菌沉淀结晶。放入50μl Pre-buf fer和3μl Lysozyme溶液混匀，放置37℃恒温箱里1小时之后，加入250μl G-buf fer混匀，在37℃培养箱培养15分钟，加入250μl Binding solution混匀，移到Spin column，离心12000rpm 1分钟 弃去过滤液，把500μl Washing buf fer A放在column离心12000rpm 1分钟，弃去过滤液，把500μl Washing buf fer B放在column离心12000rpm 1分钟，弃去过滤液，把column移到新的eppendor f f tube上，加入100μl Elution buf fer离心12000rpm 1分钟 弃去column后保管基因组DNA，用于聚合酶扩增反应（PCR）

3.2.2多聚酶链式反应：

使用通用引物27F;5'-AGAGTTTGATC[A/C]TGGCTCAG-3',1492R;5'-TACGG[C/T]TACCTTGTTACGACTT-3'),AccuPower Premix (Bioneer Corp.) 和PTC-200 (MJ Research Inc.,Water town,MA,USA)PCRmachine扩增16S rDNA。最终反应产物取2ul在1.0%琼脂糖凝胶中电泳1hr，在紫外灯下观察扩增结果。

3.2.3克隆并提取质粒DNA

按照制造公司操作说明进行：pEZ-T easy vector(RNA Corp.,Seoul,Korea)克隆。扩增的16S rRDA遗传基因，挑出70-80个镶入遗传基因的白色菌落，放入5ml LB broth 37℃震荡培养箱里培养2天，通过alkaline lysis法 按照制造公司AccuPrepTM Plasmid Ext raction Kit (Bioneer Corp.,Seoul,Korea)要求提取质粒，通过1.0%琼脂糖凝胶中电泳1hr，在紫外灯下观察镶入DNA结果。

3.2.4质粒DNA提取：

通过E.coli DH5α t ransformation的各个重组质粒DNA用alkal ine lysis方法AccuPrepTM Plasmid Ext raction Kit(Bioneer Corp.,Seoul,Korea)要求提取质DNA。

3.2.5.核酸碱基序列解读：

利用通用引物（Seq-F2(5'-ggA TTA gAT ACC CTg g-3')聚合酶链反应（PCR）扩增rDNA，送到Bioneer公司进行分析.反馈的结果使用SeqMAN(Version 5.00；DNASTAR,Inc,Madison,WI,USA)系统分析，利用GenBank数据库进行分析，相关性99%以上致病菌判定是同一种细菌种属。

4 结果

4.1分离培养的幽门螺杆菌（图1）；

4.2利用自制幽门螺杆菌尿素酶快速诊断试剂纸其观察结果：试剂纸变为红色，表明尿素酶试验呈阳性（图2）；

4.3 1.0%琼脂糖凝胶中电泳375bp出现PCR扩增产物DNA条带（图3）；

4.4利用GenBank等数据库比较核酸碱基序列相同性99%以上，可以判定是同一种属的细菌（图4）.

结论：

16S rRNA gene(16S rDNA)核酸碱基序列比较分析法，经过16S rDNA PCR扩增、复制、核酸碱基序列鉴定99%相同性，判定是幽门螺杆菌的同一种属细菌.今后收集和整理延边医院治疗前后细菌菌株分类和分布，并构建幽门螺杆菌数据库建设提科学的依据。

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图2：鉴定并委托Bioneer公司 进行分析，反馈的结果，利用GenBank等数进行核算碱基序列比较98%相同性，判定同一种属细菌