犬细小病毒高免卵黄抗体的制备与保护效果研究

周 洛

（青海省玉树藏族自治州囊谦县畜牧兽医工作站，囊谦815200）

犬细小病毒病（Canine parvovirus disease，CPVD）是由犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起犬科动物的一种急性、烈性、高度接触性传染病，主要以高热稽留、呕吐、腹泻、血便、脱水和白细胞显著减少、出血性肠炎、心肌炎为主要临床特征和病理变化[1.2]。犬细小病毒属于细小病毒科（Parvoviridae）细小病毒属（Parvovirus），病毒对环境的耐受性很强，且传播迅速，传染性强，发病率达90%以上，病死率为10%～50%[3.4]。该病毒于1977年由美国学者从患出血性肠炎的犬粪便样品中首次分离获得，随后呈全球性流行，是目前危害犬类的主要传染病之一，每年都给全球养犬业带来了巨大的经济损失。我国梁士哲等[5]于1982年首次报道了类似犬细小病毒感染所致的犬出血性肠炎，1983年徐汉坤等[6]正式报道了犬细小病毒流行情况。近年来，随着现代养犬密度的提高以及犬流动性的增强，犬细小病毒感染有日益升高的趋势[7.8]，全国各地均加强了针对犬细小病毒感染的流行病学调查[3.9.10]。为更有效地控制该病的发生与流行，加强该病预防与治疗药物的研制迫在眉睫，本研究制备犬细小病毒组织灭活疫苗，并用其多次免疫高产蛋鸡获得高免卵黄抗体，通过动物试验发现，该卵黄抗体具有良好的预防治疗效果，可应用于临床，将为犬细小病毒病的综合防治提供了一种简单、快速、经济、安全、有效的技术方法。

1 材料与方法

1.1毒株来源 经胶体金试纸条确诊为犬细小病毒感染的强阳性组织病料由西宁市某宠物医院提供。

1.2病毒的增殖与提取 将犬细小病毒感染的强阳性组织病料与3倍体积灭菌生理盐水充分混合、捣碎、碾磨后肌肉注射1月龄健康犬2只，受病毒攻击犬表现出体温升高、精神沉郁、食欲废绝、呕吐、腹泻、血便、血便带有腥臭味、脱水、休克直至昏迷死亡等肠炎型犬细小病毒典型的症状特征。无菌取病死犬的肠道及内容物与5倍体积灭菌生理盐水充分混合、捣碎、碾磨、反复冻融、4层纱布过滤后，即得含犬细小病毒的病毒液，-20℃保存备用。

1.3组织灭活疫苗的制备 取-20℃保存的病毒液500mL，加甲醛1.0mL，置37℃温箱中灭活24h，期间每隔4h摇晃1次。取灭活后的病毒液吐温-80溶液20mL，组织捣碎机高速搅拌匀浆，即得水相。取96mL白油和4mL司本充分混合后加入4mL硬脂酸铝，高压灭菌，即得油相。以油相与水相3:1的比例进行乳化，配置油包水型组织灭活疫苗，4℃保存备用。

1.4蛋鸡的免疫 取40周龄健康产蛋鸡30只，产蛋率在85%，以制备的组织灭活疫苗进行免疫，首次免疫肌肉注射0.5mL/只，14d后进行第二次免疫，二免肌肉注射1.0mL/只，14d后进行第三次免疫，三免肌肉注射1.0mL/只，第三次免疫14d后收集鸡蛋。

1.5卵黄抗体的提取将收集的鸡蛋用水冲洗干净后，依次使用碘酒和75%酒精擦拭消毒后，超净工作台中无菌分离卵黄，与等体积灭菌磷酸盐缓冲液（PBS）捣碎匀浆后，参照王建梅等[11]的盐析法分离纯化卵黄抗体。

1.6抗体效价测定 采集并制备1%猪红细胞，按常规的血凝抑制试验（HI）方法测定卵黄抗体的抗体效价。

1.7安全性试验 取健康犬10只，将制备的高免卵黄抗体分别经口服和肌肉注射健康犬各5只，2.0mL/只，观察记录试验犬的食欲、精神状态、异常反应等，观察至14d。

1.8保护效果试验 将20只1月龄健康犬随机分成4组（I组、II组、III组、IV组），每组5只，各组犬均肌肉注射1.2中制备的病毒液1.0mL，48h后I、II、III组每日分别口服制备的卵黄抗体0.3、0.5、1.0mL，连续服用2d，IV组为对照组。隔离饲养观察至14d，掌握分析卵黄抗体不同使用剂量对患病犬的治疗效果。

2 结果与分析

2.1卵黄抗体效价测定结果 采用HI试验方法测定卵黄抗体的抗体效价达1:512。

2.2安全性试验结果 10只试验犬食欲、精神状态均良好，无任何异常反应。

2.3保护效果试验结果 如表1所示，对照组的5只犬中4只死亡，死亡率高达80%，而卵黄抗体0.3、0.5、1.0mL使用剂量组的5只犬分别死亡3、1、0只，保护率分别达40%、80%和100%。表明当卵黄抗体的使用剂量大于0.5mL时，对犬细小病毒的感染即可产生有效的保护作用。用犬细小病毒作为免疫抗原制备的犬细小病毒高免卵黄抗体，通过被动免疫可使犬获得坚实的保护力，将成为特异性地预防和治疗犬细小病毒病的良好生物制品。而在卵黄抗体母体来源的选择上，蛋鸡易于饲养，产蛋量高，一直是大批量生产卵黄抗体的首选试验动物，且应用异源动物制备卵黄抗体，降低了同源疫病传染的危险。卵黄抗体的提取方法是能否获得高效价抗体的关键，王建梅等[11]通过比较分析发现酸化法、水稀释法提取卵黄抗体对pH值和操作方法要求比较严格，在试验过程中较难掌握，将直接影响提取卵黄抗体的效价，而盐析法受到外界环境因素的影响较小，提取过程简单、快速，制备的抗体效价亦较高。故本研究采用蛋鸡作为抗体来源的试验动物，采用盐析法提取卵黄抗体，制备出的鸡源犬细小病毒卵黄抗体的抗体效价达1:512，1.0mL使用剂量对人工感染犬细小病毒的治愈率达100%，具有较好的治疗效果，为犬细小病毒病的综合防治提供了一种简单、快速、经济、安全、有效的技术方法，同时也为其它动物疫病的异源高免卵黄抗体的制备与应用提供了有益的经验。

表1 不同剂量卵黄抗体对犬感染CPV的治疗效果

3 讨论

随着全球养犬业和宠物行业的快速发展，我国养犬数量不断增加，犬细小病毒感染已严重阻碍我国养犬事业的稳定与健康发展，目前犬细小病毒病尚无十分有效的治疗方法和药物，我国对其实行以疫苗免疫为主的综合防控措施，但由于宠物犬分散、受犬母源抗体干扰、疫苗运输保存不善、免疫程序不合理以及个体差异等常导致免疫失败，疫苗免疫效果不确实。研究探讨治疗制品一直是临床领域的关键课题，用单克隆抗体制剂、犬细小病毒高免血清或犬细小病毒感染后康复犬血清对患病犬进行被动免疫效果虽好，但由于效价不稳定、且血清采集难度较大，制造过程繁杂，产量低，成本高、不能满足大量生产的需要。卵黄抗体化学性质稳定，具有一定的耐酸、耐碱、耐热性能，且具有制造简单、成本低、产量高、安全高效等特点，在其它动物传染病的综合防控中已取得了良好的临床应用效果。采

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