麻疯树组织培养研究

赵雪慧，何 德

（西南林业大学 生 命科学学院，云南 昆 明650224）

1 引言

在化石能源日益枯竭的今天，麻疯树（Jatrophacurcas）作为一种生物柴油树种，生物质能源的重要来源，因为其果实的高含油量，越来越受到世界各国的关注。据报道，麻疯树的果实含油量能高达40%［1］。虽然麻疯树种子含油率很高，但是其果实的产量问题却是一大难题，究其原因，麻疯树是一种雌雄同株异花的植物，雌雄花位于同一个花序，但是同一个花序的雌花的数量却要远远小于雄花，有研究者指出麻疯树同一花序上，麻疯树的雌雄花比例大致为1∶10～1∶20［2～4］，这直接限制了麻疯树的大批量种子繁殖，于是各国学者纷纷将目光投向了组织培养。作为当今生物学领域普遍使用的繁殖技术，组织培养有许多的优点，能够保存母本的优良性状。目前关于麻疯树的组织培养已有一定的成果，许多研究者分别使用不同的外植体、不同激素、不同环境对麻疯树的组织培养进行了研究，普遍使用的是MS基本培养基，辅以BA、TDZ、IBA、NAA等外源激素，以实现麻疯树组培苗的快繁［5～10］。目前尚未见到使用其他基本培养基对麻疯树进行组织培养。组织培养是否能够获得成功，培养基的选择是非常重要的一个环，不同的培养基具有不同的特点。MS培养基由于其无机盐和离子浓度较高比较稳定，养分数量和比例合适，能满足植物细胞所需要的营养和生理需要，被广泛应用，但是其他种类的基本培养基在麻疯树的组织培养中是否会具有比MS培养基更高的效率呢，比如WPM培养基，被誉为木本植物培养基，是否会更适合麻疯树的组织培养？为了探究其他种类基本培养基在麻疯树组织培养中的表现，为麻疯树的组织培养研究做一个补充，本研究以麻疯树无菌苗为外植体使用了几种基本培养基进行麻疯树的组织培养。

2 材料与方法

2.1 材料、试剂与仪器

麻疯树种子采自云南金沙江边干热河谷区，4℃条件下保存于西南林业大学生物技术实验室。

硝酸铵、硝酸钾、硫酸镁、磷酸二氢钾、氯化钙、硝酸钙、碘化钾、硼酸、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）、肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸、甘氨酸、升汞，均为分析纯试剂；白砂糖；卡拉胶。

BS223S型电子天平（0.001g），Sartoruis；SX－500灭菌锅，TOMY；BCD－196电冰箱，美菱；MW－2070M微波炉，海尔；SW－CJ－2FD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；1810－B型石英自动双重纯水蒸馏器，江苏省宜兴市勤华石英玻璃仪器厂；YBOFB2型空调，格力；T836W／765型日光灯，FSL佛山照明；LL－200P型电磁炉，佛山市顺德区劳莱斯电器有限公司。其他工具还有移液枪，烧杯，量筒，容量瓶，玻璃棒，漏斗、剪刀、解剖刀、镊子、酒精灯等。

2.2 方法

2.2.1 外植体表面消毒

将麻疯树成熟饱满种子去壳后在次氯酸钠与水1∶1的混合溶液中浸泡20 min，期间适当搅拌，接着流水冲洗干净种子表面的次氯酸钠，放入清水中备用。将处理好的种子放入超净工作台，首先使用75%酒精浸泡30 s，使用无菌水清洗3遍，每次浸泡3 min左右，去除残留酒精。然后在0.1%的升汞溶液中浸泡15 min后用无菌水清洗3次，每次3～5 min，尽可能洗去升汞残留。将消毒完成的种仁，放入无菌水中备用。

2.2.2 无菌苗的萌发

沿种仁纵轴切开，除去胚乳，小心取出完整的幼胚，胚轴向下接种于MS、LM、WPM、N6这4种基本培养基中，培养基中不添加任何外源植物激素。每种培养基20个重复，每个重复一个幼胚，观察各培养基中无菌苗的生长情况，15 d内统计数据。

2.2.3 愈伤组织诱导

取15 d苗龄的麻疯树，子叶和真叶切割为1 cm×1 cm大小，下表面接触培养基接入培养基上，胚轴横向切割为1 cm左右长短横放于培养基上，培养基配方为MS／WPM／N6／LM＋BA1.0mg／L＋IBA0.5mg／L＋TDZ0.1 mg／L，pH 值5.8。每个处理3个重复，每种培养基15～20个外植体，观察愈伤组织的诱导情况，4周内统计数据。

2.2.4 不定芽的分化

将健康的愈伤组织切成小块接种到培养基MS／WPM／N6／LM＋BA3.0 mg／L＋IBA0.5 mg／L＋GA31 mg／L上，每个处理3个重复，每个重复15～20个外植体，观察愈伤组织诱导不定芽的时间、形态、数量等，4周内统计数据。4周后，将丛生的不定芽分成2株一丛，转接入不定芽诱导培养基，使其继续增殖。

2.2.5 不定芽的伸长

将健康并且株高在2 cm以下的不定芽，转入不定芽伸长培养基 MS／WPM／N6／LM＋BA 0.1mg／L＋IBA 0.2 mg／L，每个处理3个重复，每种培养基15～20个外植体，观察不定芽抽长的长度和长势等，测量其株高平均值变化，4周内统计数据。

2.2.6 生根诱导

将株高在2.5 cm以上的再生苗接入不添加任何外源植物激素的4种基本培养基上培养一周，降低苗体内激素水平，之后接入培养基1／2（MS／WPM／N6／LM）＋NAA0.5 mg／L＋IBA0.2 mg／L进行生根诱导，每个处理3个重复，每种培养基15～20个外植体。观察记录生根的数量、长度、形态，4周内统计数据。

若没有特别说明，培养条件都是25±2℃，光照周期16 h／d，光照强度3 000lx。

3 结果及结论

3.1 无菌苗的萌发

4种培养基中无菌苗的萌发率都比较高，而且比较健康，推测是因为子叶贮存了一定的营养物质，但是各培养基中无菌苗生长状况有所不同。N6培养基中的幼胚胚根最先长出，MS和WPM稍晚一些，LM培养基中最晚，各培养基中胚根都比较健康，呈白色，数量一般3～5根。子叶均比较肥厚，脉络清晰，N6培养基中无菌苗茎干最为粗壮，平均株高最高，真叶出现的时间也较早，第8 d出现第一片真叶，LM依然是最后出现真叶的，但是各培养基中无菌苗长出的真叶，基本无畸形叶，并且叶脉清晰。各培养基中无菌苗萌发情况见表1。

表1 4种培养基中无菌苗萌发情况

3.2 愈伤组织的诱导

接种一周左右，外植体边缘、末端开始膨大、卷曲，逐渐增厚，颜色渐渐变浅，出现淡黄绿色、浅绿色或者白色疏松、较致密愈伤组织。白色的愈伤组织在后续的培养中容易褐化死亡，不易分化出不定芽；淡黄绿色和浅绿色疏松愈伤组织的不定芽分化率比较低，并且芽苗比较矮小，茎段较细；浅绿色较致密愈伤组织分化不定芽能力比较强，并且在一段时间的培养之后在边缘有出现芽点。MS和WPM培养基中子叶愈伤组织大多呈浅绿色，较致密，并且出现的芽点较多，有的茎段直接诱导出了小苗，N6培养基和LM培养基中几乎没有出现芽点，愈伤组织也不如MS和WPM培养基中的多。4种培养基中外植体愈伤诱导情况见表2。

表2 4种培养基中愈伤诱导情况

3.3 不定芽的诱导

接种一周左右，愈伤组织开始出现隆起，个别隆起会分化出正常的不定芽，其他的隆起或者一直是突起状态或者形成畸形芽，畸形芽茎干很粗，没有叶片或者叶片很小容易脱落，可能是由于细胞分裂素浓度太高的原因。4种培养基中，WPM培养基中不定芽分化数量最多，并且平均株高比较高，幼苗叶片翠绿，叶脉清晰，叶形正常，LM培养基中不定芽分化比较少，并且比较弱小（见图1）。各培养基中不定芽分化情况见表3。

表3 4种培养基中不定芽分化情况

3.4 不定芽抽长诱导

经过抽长培养，各培养基中的组培苗都有一定程度的抽长，4种培养基中不定芽的伸长并没有很大的差异，都在1 cm左右，可见在抽长培养中，主要起作用的是激素。

3.5 生根诱导

培养2周后，LM和WPM培养基中幼苗最先出现幼根，基本在3条左右。4周后，MS生根率大致为60%，LM和WPM都达到90%以上，N6生根诱导率最低，为34%。LM培养基中幼苗主根发达，粗壮，侧根很少；WPM培养基中的幼苗主根数量较少，侧根很发达；MS培养基中的幼苗主根短粗，少侧根；N6培养基中的主根数量较少，并且比较短，其上有侧根的突起（见图2）。各培养基中不定芽生根情况见表4。

表4 4种培养基中幼苗生根情况

图1 不定芽的诱导情况

图2 幼苗生根情况

综合以上情况，笔者认为在以麻疯树无菌萌发苗作为外植体时，WPM培养基更为适合麻疯树的组织培养，在各阶段的表现都比较稳定。

4 展望

麻疯树的组织培养研究现在存在的主要问题在于重复性比较低，难以用于大规模的工厂化生产，缺少一个高效、稳定的再生体系，还需要研究者们进一步的进行研究。麻疯树现在已经成为生物能源的研究热点，但是其低产量仍然是困扰各国学者的一大难题，许多学者在提高其产量方面进行了非常多的研究，今后的研究重点应该是集中在其性别分化机制及雌雄花比例方面，从分子、细胞、组织培养等各种方面研究促进其雌雄花比例升高，以提高结实率，以提高产油量，缓解能源危机。

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