四川达州地区山羊伪结核棒状杆菌病的诊断及药敏试验

张梦思，李和贤，周作勇

（西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌402460）

四川达州地区山羊伪结核棒状杆菌病的诊断及药敏试验

张梦思，李和贤，周作勇

（西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌402460）

自2014年以来，四川达州地区众多羊场所饲养的山羊皮肤出现“长包”现象，有的羊场发病率甚至高达30%，但该病致死率很低。随着该病在羊群中越来越多，很难彻底根除，且导致山羊生产性能明显降低，才引起饲主重视。2015年5月，笔者对达州地区宣汉县发病山羊采集病料，经实验室确诊为山羊伪结核棒状杆菌病，进一步进行药物敏感试验，为该地区用药提供指导，报告如下。

1 发病情况

不同品种的山羊均可发病，主要发生于3月龄以上，以成年羊为主，1～2月龄羔羊极少发生。患病羊多数呈慢性经过，主要在头颈部、肩前、股前甚至乳房等处出现局灶性肿块，俗称“包”，其大小不一。随着病情的发展，包块逐渐肿胀、增大，大者可达鸭蛋大小，初期触之较硬，之后开始化脓变软，并有波动感，发展到后期浅表的脓肿自行破溃，流出乳白色浓稠的牙膏状脓汁，脓汁排后数日伤口会痊愈，但常会在原处或者其周围发生新的脓肿，整个病程大多为1个月左右，有的可达3个月。患病山羊极少发生死亡，部分发病羊表现为皮肤瘙痒，经常相互摩擦或在墙上摩擦，严重的病羊出现全身性感染，表现为咳嗽、食欲下降、体重下降。

2 实验室诊断

2.1 病料采集以5mL无菌注射器从发病症状典型的两头波尔山羊脓肿中抽取脓汁（见中插彩版图1），低温送回实验室待检。

2.2 细菌分离培养将病料分别接种在普通营养琼脂、普通营养肉汤、含10%犊牛血清的肉汤、麦康凯琼脂和血平板琼脂培养基上，37℃培养24～48 h，观察菌落形态。结果：从所采集的两个脓汁样本中均分离出细菌（编号分别为XH-1和XH-2），细菌在普通营养琼脂和普通营养肉汤内生长不良，但在含10%犊牛血清的肉汤内生长良好，接种24 h血清肉汤明显变浑浊，且有白色菌膜出现，试管底有颗粒样物质沉淀。分离菌在血琼脂平板上生长良好，接种24 h出现针尖大小的菌落，48 h后出现1mm大小，灰白色、不透明、干燥、中央凸起、边缘不整齐的菌落，菌落在培养基上附着不牢，铂金耳易将其滑动却难挑起，该菌在血平板上面出现狭窄β型溶血环，但传代后不溶血。在麦康凯培养基上无细菌生长。

2.3 涂片镜检将培养物涂片进行革兰染色镜检，可见大量球杆状的革兰阳性菌，无荚膜、鞭毛和芽孢，多呈散在分布，该菌的排列与葡萄球菌的排列颇为相似（见中插彩版图2）。2.4细菌16S rDNA的扩增、测序及分析以细菌基因组提取试剂盒分别提取分离菌的基因组DNA，以16S rDNA通用引物（上游5′-AGAGTTT⁃GATCCTGGCTCAG-3′，下游5′-CGGCTACCTTGT⁃TACGACTT-3′）进行PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳。结果，两个分离株均获得长度约为1 500 bp的扩增片段（见中插彩版图3）。将扩增的PCR产物送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，分别获得的序列长度为1 398 bp和1 394 bp，经Blast在线比对分析，2株分离菌16S rDNA序列与Gen⁃Bank已收录的伪结核棒状杆菌（ATCC 19410，登录号为NR_115562.1）相应的基因序列同源性最高，分别为98%和99%，结合两株细菌的培养特性及染色特点确定分离菌为山羊伪结核棒状杆菌。2.5致病性试验取山羊伪结核棒状杆菌在含10%犊牛血清肉汤的24 h纯培养物进行试验：（1）对小鼠的致病性试验：将小鼠分为1个对照组，分离菌接种1组和2组，每组3只，分离菌接种组小鼠经腹腔注射对应菌液0.3mL，对照组注射含10%犊牛血清肉汤0.3mL。结果分离菌接种组小鼠在2 d内全部死亡，从死亡小鼠肝脏中分离获得与接种菌一致的致病菌，而对照组小鼠仍健康存活。证实所分离的伪结核棒状杆菌具有较强的致病性；（2）感染途径试验：取健康小白鼠10只，分灌胃组、滴鼻组、皮下注射组、腹腔注射组和对照组，每组2只。对照组腹腔注射10%犊牛血清肉汤，其余试验组小鼠按相应途径每只接种0.1mL菌液。结果腹腔注射的两只小鼠在3 d内死亡；皮下注射的两只在第8天左右注射部位开始脓肿，11 d左右自行破溃，流出黄绿色脓汁，13 d左右开始结痂愈合，病情发展快者在原处附近又开始发生新的脓肿，14 d将其致死剖检发现其仅颈部淋巴结肿大，内部器官并无明显眼观病变；其余6只小鼠于14 d扑杀，剖检发现灌胃的小鼠仅肠壁上有少量米粒大小的脓包，而滴鼻的小鼠在其肠壁、肾脏上面有米粒至豌豆大小不等的脓包，胸腺肿大。对照组小鼠无异常表现和剖检病变。本试验证实伪结核棒状杆菌可以经多途径感染发病。

2.6 药敏试验采用纸片扩散法进行药敏试验，用灭菌的涂布棒将100μL伪结核棒状杆菌菌液均匀涂布在鲜血琼脂培养基上，待菌液被完全吸收后，将不同的药敏试验贴在培养基的适当位置，37℃培养24 h，观察记录抑菌圈大小，判定依照美国CLSI标准。结果2株分离菌药敏谱基本一致，大部分抗生素对伪结核棒状杆菌均有一定的抑制作用，其中分离菌对四环素、氯霉素、诺氟沙星、米诺环素、头孢西叮、克拉霉素及罗红霉素等13种药物高度敏感；XH-1和XH-2对甲氧嘧啶和头孢曲松分别为中敏和高敏；对呋喃妥因和呋喃唑酮则表现为完全耐药（表1）。

表1 伪结核棒状杆菌药敏试验

3 讨论

3.1 根据上述临床症状，分离菌形态、培养特性，分离细菌16S rDNA序列的同源性比对结果，以及致病性特点，可判定该羊场山羊所患病为伪结核棒状杆菌病。

3.2 羊伪结核棒状杆菌病是由伪结核棒状杆菌引起的一种人畜共患慢性传染病，国外多称之为干酪样淋巴结炎（CLA）［1］。本病在世界上养羊的各个地区都普遍存在，我国内蒙古、陕西、甘肃、新疆、云南、贵州、上海、浙江、广西和广东等地均有报道［2］，而在四川省仅见攀枝花有过报道［3-4］。由于该病发病缓慢，且致死率一般较低，所以常常被人们忽视。据调查很多养殖场山羊首次发病时，养殖户均会采取措施进行处理，如对发病羊注射抗生素，同时切开脓肿进行排脓清洗消包等，随后发现该病不易造成死亡，很多情况下均不再做任何处理，而是让脓疮自行破溃、流脓结痂。因脓汁外流极易将病原传播给同群山羊和污染环境，这也是该地区山羊伪结核棒状杆菌病年年发生的重要原因。近年来，西南地区山羊养殖量快速增多，山羊伪结核棒状杆菌病呈现出大面积流行，感染严重时可造成生产性能下降甚至死亡，加之该菌对人也有致病性，需引起人们的足够重视。

3.3 羊伪结核棒状杆菌病是难以治疗的传染病之一，一旦侵入羊群则很难彻底清除。目前，治疗该病的方法主要有药物和手术治疗。用于该病防治的药物包括多种抗生素和中草药等，本次药敏试验结果证实，山羊伪结核棒状杆菌对很多种抗生素敏感，这可能与该地区抗生素在山羊上使用较少有关。然而资料报道，多种抗生素在临床上治疗效果并不理想，其原因可能是：（1）包囊膜为一层厚而致密的纤维性肉芽肿，诸多药物难以通过，无法渗入其内；（2）伪结核棒状杆菌可寄生于细胞内，使得一些药物对其难以发挥作用；（3）包囊内脓汁干稠，药物难以均匀地扩散于整个脓肿，不能彻底杀死脓肿内的病原菌。因此，在对患羊进行药物治疗的同时，采取手术切开其脓肿排脓，清洗消毒，疗效会更好。马成贵等人用此法治疗多例，均1次治愈［5］。

3.4 由于临床用药物防治羊伪结核棒状杆菌病不理想，目前也无可有效防治该病的疫苗，因此采取综合性的预防措施才是防治该病的根本。不要从有伪结核病史的羊场引种，隔离饲养并及时治疗发病羊，严格消毒和清除病羊排出的脓汁，避免污染周围场所及饲草。同时应视情况淘汰患羊以净化羊群［6］。

［1］Seyfert N，Silva R F，Jardin J，etal.Serological proteome analysis of Corynebacterium pseudotuberculosis isolated from different hosts reveals novel candidates for prophylactics to control caseous lymphadenitis［J］.Veterinary Microbiology，2014，174：255-260

［2］郑敏，胡杰，欧绍毅，等.广西黑山羊伪结核棒状杆菌的分离与鉴定［J］.广西农业科学，2010，41（10）：1128.

［3］杨应东，童俊青，陈明华，等.四川某圈养山羊场干酪性淋巴结炎病的调查与措施建议［J］.攀枝花科技与信息，2011，36（3）：46-47.

［4］曾泽，韦雷飞，黄秀君，等.一起山羊伪结核棒状杆菌感染的诊断［J］.动物医学进展，2014，35（3）：131-133.

［5］马成贵，王小虎.山羊“长包”病防治的体会［J］.养殖技术顾问，2012，9：85.

［6］宋先利.山羊伪结核病的诊治要点［J］.中国畜牧兽医文摘，2013，29（6）：143.

S852.61+8

B

0529-6005（2015）12-0054-02

2015-7-24

中央高校基本科研业务费专项资金资助（XDJK20-15C030）；西南大学博士启动基金（2013Bsr07）

张梦思（1995-），女，本科生，学习方向为动物医学，E-mail：1418121852@qq.com

周作勇，E-mail：zzyxnny@163.com