富含多酚类植物RNA提取的研究进展

刘

（湖南农业大学农学院/国家油料作物改良中心湖南分中心，长沙410128）

富含多酚类植物RNA提取的研究进展

刘芳，官春云*

（湖南农业大学农学院/国家油料作物改良中心湖南分中心，长沙410128）

摘 要：植物体内广泛存在多糖、多酚等次生代谢物，由于其易被氧化，且难以与核酸分离，导致了RNA提取困难。针对植物多酚类化合物的结构及生物学特性进行分析，将现有的RNA提取方法进行分类，并对它们的原理及优劣进行了论述与评价。

关键词：植物；RNA提取；多酚；CTAB-LiCL法；SDS-酸酚法

RNA，即Ribonucleic Acid，是一种极为重要的生物大分子物质。它能够传递遗传信息，是DNA参与蛋白质合成的重要媒介。任何基因功能的有效发挥均依赖RNA的表达与调控，所以RNA在分子生物学研究领域占有重要地位。

高质量的RNA提取是进行分子生物学实验的必要前提，如cDNA文库的构建、荧光定量PCR检测、Northern杂交等。因此，从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是顺利进行上述研究的关键所在［1］。

目前，RNA提取主要采用的是Chomczynski等提出的异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法，即Trizol法［2］。由于其高效简洁，在动植物细胞RNA提取上广泛运用，但无法提取富含多酚类植物组织总RNA［3］。多酚是植物细胞中的一类次级代谢物，其种类繁多，结构各异，含量仅次于纤维素［4］，因其具有多个酚基团而得名。多酚易被氧化形成醌类物质与RNA不可逆的结合，导致提取的RNA纯度降低，影响后续的分子实验进行。

多酚为RNA提取增加了难度，同时多酚类植物广泛存在，如草莓［5］、葡萄［6］、棉花［7］、芒果［8］等都富含多酚。因此如何应对多酚类植物RNA提取的难题亟待解决。本文对含多酚类植物的RNA提取方法进行分析总结，主要从多酚生物学特性、RNA提取方法以及不同沉淀方法三个方面进行了阐述。

1　植物多酚的结构及生物学特性

多酚主要存在于植物的皮、果、种子及叶中，依据其化学结构的差异，可以分为水解单宁（蒬酸酯类多酚）和缩合单宁（黄烷醇类多酚或原花色素）（图1）。另有研究表明，缩合单宁（原花色素）的含量是影响植物RNA提取的重要因素［9］。

图1　植物多酚的化学结构式［4］

植物多酚富含丰富的邻位酚羟基官能团，这使得它具备了如下的生物性质：（1）植物多酚极易同蛋白质、多糖通过氢键作用发生复合反应，从而抑制生物酶的活性［10］；（2）植物多酚能够与Cu2+、Zn2+等金属离子络合，使含这些离子的金属酶活性受到抑制，这可能也是多酚具有抑制酶活性、抗病毒、抗微生物等生物活性的原因之一［11］；（3）植物多酚易被氧化为醌类物质（醌类物质易于同大分子RNA结合）［12］，具备较强的生物还原能力。

由于植物多酚的强还原性，使得它成为植物抵御逆境胁迫的一种重要次级代谢物。在棉花中，植物多酚的积累能够抑制病虫害的产生［13］。在干旱、高温、强烈的紫外线照射下，植物多酚能够高效清除细胞因逆境胁迫产生的氧自由基，从而达到保护细胞膜系统的稳定性［14］。在低温环境中，植物细胞合成大量多酚，借此来提高细胞质浓度，降低冰点，维持细胞正常功能的发挥［15］。因此，植物多酚虽然给RNA提取造成困扰，但其对细胞维持生理学功能起到关键作用，是植物正常生长所必须的一类高分子化合物。

植物多酚根据其溶解性分为难溶性多酚和可溶性多酚，其中后者是RNA提取的主要障碍。可溶性多酚具备一定极性，易溶于丙酮、乙酸乙酯和乙醚，在有机溶剂中加入少量酸性或一定比例的水，形成强极性的萃取剂，可以提高多酚的提取效率［16］。林娜等［17］采用乙酸乙酯与PVP对样品进行前处理，高质量提取出了油樟叶片的总RNA。因此，充分认识植物多酚，针对其理化性质，改良实验方法，可以克服多酚对植物总RNA提取的干扰。

2　富含多酚类植物总RNA提取方法

目前，植物总RNA提取方法有Trizol法、试剂盒法（异硫氰酸胍法）、十二烷基硫酸钠-酸酚法（SDS-酸酚法）［18］、十六烷基三甲基溴化铵-氯化锂法（CTAB-LiCl法）［19］、高氯酸盐法［20］等。李菁芳等［21］依据提取液的性质，将RNA提取法分为氧化剂法和还原剂法，其中氧化剂RNA提取法包括Trizol法、异硫氰酸胍法、高氯酸盐法，还原剂RNA提取法包括SDS-酸酚法、CTAB-LiCl法。

氧化剂RNA提取法（如Trizol法）最先运用于动物细胞总RNA的提取，其原理是利用提取液中异硫氰酸胍的强变性氧化能力使细胞膜裂解、蛋白质变性，抑制内源RNase活性的发挥，同时使核酸释放于水相之中。该方法具备操作简单、RNA提取完整性好等优点，适用于一些次生代谢物含量少的植物组织。但是，氧化剂RNA提取法在植物组织总RNA提取中还存在较大局限性，这是因为多数植物组织中均积累有多酚类物质，而多酚类物质在提取的过程中会被氧化成棕褐色的醌类化合物，从而与核酸大分子不可逆结合，使用氯仿抽提去除多酚类物质的同时，造成RNA丢失［22］，多糖会形成胶状沉淀物，与小分子核酸共沉淀［23］。因此，氧化剂RNA提取法不适用于富含多酚类植物总RNA的提取。

目前，还原剂法成为富含多酚类植物总RNA提取的主要方法，其依赖于β-巯基乙醇清除提取液中氧化性物质，提供一个强还原性环境，从而保证多酚类物质不被氧化［24］，再利用PVPP（交联聚乙烯吡咯烷酮）、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、CTAB与多酚极强的络合能力，经氯仿抽提，借以将大部分的多酚类物质清除，从而高质量的提取植物总RNA。还原法具体分为两种：CTAB-LiCl法、SDS-酸酚法。

CTAB-LiCl法是一种广泛运用的RNA提取方法，分别提取了百合［25］、山药［26］、油菜种子［27］、红树［28］等多种植物的总RNA。其提取的RNA具备纯度高、产率高的特点。

CTAB，十六烷基溴化氨，是一种阳离子表面活性剂，在高离子强度的溶液里，CTAB能够与蛋白质、多酚和中性多聚糖形成复合物沉淀，使核酸溶解于水相之中，达到分离核酸的目的。PVP，其自身的CO-N=基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强。原花色素类物质中含有许多芳环上的羟基，因而可以与PVP形成稳定的复合物［29］。高浓度的氯化钠（2 mol/L）为CTAB提供了一个高盐的环境，促使其与蛋白质、中性多糖形成复合物，但并不能改变酸性多糖的溶解性质。因此，酸性多糖的清除依赖于氯化锂对大分子核酸的沉淀，而此时酸性多糖依然溶解于上清之中。

CTAB-LiCl法能够高质量的提取多酚类植物总RNA，但依然存在些许不足。65℃的水浴加热CTAB法提取植物总RNA非常重要。在这个温度下，CTAB可以增加细胞膜的表面张力，使蛋白质变性，使核酸高效的从细胞中释放出来，提高RNA提取产率；同时，CTAB与多酚、多糖等杂质结合能力也随着温度的提高而增强。若不经过65℃温育，CTAB-LiCl法所提取的总RNA，因杂质含量高，而无法进行反转录。但是，65℃为RNA的变性温度，在成分复杂的植物RNA提取混合液中，长时间的温育对RNA的结构造成严重破坏，从而导致RNA的降解，产率下降。

SDS-酸酚法经多次改良，也广泛应用于多酚类植物总RNA的提取。

SDS，十二烷基硫酸钠，一种阴离子表面活性剂，能够使蛋白质变性、裂解细胞膜，而使核酸溶于提取液中。不需要温育加热，常温下具备较强的裂解效果。苯酚具备强腐蚀性，对蛋白质有着极强的变性作用，可以完全抑制内源RNase活性的发挥。植物粉样经SDS提取液裂解，由酚、氯仿混合抽提，可以将溶液中蛋白质、多糖、SDS、DNA分离至有机相中，而RNA则留在上清之中。与CTAB-LiCl法相比，SDS-酸酚法具有操作简单、提取时间短的特点。但是，在RNA提取过程中，较高含量的多酚类杂质，也是该方法的致命缺陷。常规SDS-酸酚法所提取的植物总RNA无法进行反转录实验，需要借助于PVPP提升其去除多酚杂质的能力。

3　沉淀剂对富含多酚类植物RNA提取的影响

3.1LiCl

LiCl是一种强脱水剂，可以降低核酸（DNA和 RNA）在溶液中的溶解度，使蛋白质从染色质上脱离。LiCl的浓度高低使其具备针对核酸（DNA和RNA）沉淀选择特异性。在溶液中，1 M LiCl能特异性的结合RNA大分子而选择性沉淀，将DNA留在上清之中［30］；但随着其浓度提高，LiCl与DNA分子结合能力逐渐增强，其沉淀RNA的效率不断降低［31］，所以合适的浓度是保证RNA提取纯度的关键。LiCl与RNA分子结合发生沉淀是一个缓慢的过程，为了加快LiCl与RNA分子的结合效率，同时保证RNA分子不被降解，一般采取的措施是将其混合液放置于4℃下静置数小时。部分学者认为LiCl沉淀时间过长会引起RNA的降解，进而影响总RNA的产率。但是宋蓓等［32］通过实验证明RNA产率随着沉淀时间的延长而大幅增加。

LiCl法沉淀的RNA纯度高、完整性好，但是依然存在着诸多不足。首先，LiCl在与RNA分子反应的同时，也会部分与多糖多酚类物质结合沉淀。如提取富含多酚类植物（如棉花、油茶、油樟等）的RNA时，由于组织中多酚类物质高于一般植物，致使其提取液中仍含有大量杂质，经LiCl沉淀所得RNA中多酚类杂质含量较高而无法用于后续的分子实验。所以使用LiCl沉淀RNA的前提是CTAB、PVPP等高效的将植物组织中的多酚、多糖类杂质清除。其次，LiCl沉淀会造成小分子RNA的丢失，同时沉淀中残存的锂离子也会抑制RNA的反转录。

3.2乙二醇丁醚

乙二醇丁醚，又名丁氧乙醇，具有刺激性气味。在钠离子浓度为80 mmol/L时，0.4倍体积的乙二醇丁醚能选择性沉淀多糖，而且1倍体积的乙二醇丁醚能溶解多酚类物质的同时沉淀核酸［33］。相关文献报道，乙二醇丁醚对RNA具备良好的沉淀效果，并相继应用于草莓、麻疯树种子［34］。淳俊等［34］以乙醇、异丙醇、乙二醇丁醚设立对照试验，依据试验结果，认为乙二醇丁醚沉淀效果远大于乙醇和异丙醇。张容等［35］认为，浓度为50%的乙二醇丁醚可以沉淀RNA的同时将多酚溶解，经离心除去。但是李菁芳等［21］、尤超等［36］使用乙二醇丁醚提取杉树、银杏等植物材料后，认为乙二醇丁醚在去除多糖多酚的过程中，造成了RNA的大量流失。综上所述，乙二醇丁醚能在沉淀RNA的同时仍然保持多糖多酚类杂质在溶液中的溶解度，提取的RNA纯度高且操作步骤简单，但是其对所提取的植物材料范围有着一定的局限性，若含有多糖多酚类杂质过高的植物组织（银杏、油樟等）则不适用于该法的RNA提取。

3.3乙醇及异丙醇

乙醇、异丙醇，二者都是良好的RNA沉淀剂。但是在使用乙醇沉淀RNA时，需要同时加入终浓度为0.3 M的醋酸钠，这是因为钠离子会中和RNA磷酸骨架上的负电荷，在酸性环境中促进RNA的疏水复性，再加入2倍体积的乙醇，经一定时间的孵育，可以使RNA有效沉淀［37］。与使用乙醇沉淀RNA相比，异丙醇法更为简单，向抽提上清中加入等体积异丙醇，低温孵育便可获得RNA沉淀。但经异丙醇沉淀所得RNA相较于乙醇则质地排布更加紧密，不利于70%乙醇清洗及Li+、Cl-等离子型杂质的清除。二者沉淀RNA效率极高，但针对多糖多酚类杂质缺乏针对性清除能力，致使沉淀中裹挟有大量的多糖多酚类物质，不利于下一步分子生物学实验。

4　总结及展望

富含多糖多酚类植物组织因杂质含量高，而难以得到高质量的RNA。植物多糖能够抑制多种生物酶的活性［38］，其理化性质与RNA非常接近［39］，能够与核酸、蛋白质、多酚类物质发生结合，是影响RNA提取的重要因素。但植物多糖的清除难度与多酚相比较小，低浓度乙醇法［40］、醋酸钾法［41］、LiCl法［30］、乙二醇丁醚法［42］在清除植物多糖过程中有着广泛的应用，并取得了良好的效果。由此，植物多酚成为影响植物RNA提取最为主要的因素。植物多酚因具备强的被氧化和络合能力而不易被有效清除。植物多酚是植物体抵御逆境胁迫的一类重要的次级代谢产物［43］，故生长环境越恶劣，其体内积累的多酚类物质越多。同时，多酚在植株重要器官如花、种子、果实、根，均有大量积累。这使得我们必须正视多酚在RNA提取中所发挥的负面作用，并根据植物材料的特性（多糖、多酚含量），选择合适的方法。

富含多酚类植物总RNA提取主要依赖于还原剂法，即CTAB-LiCl法和SDS-酸酚法。近年来，许多学者针对此两种方法进行了多种改良，但其原理并无太大改变。CTAB-LiCl法能够有效清除植物多酚，原因在于CTAB、PVP或PVPP均可与多酚结合，其中CTAB结合多酚能力大于PVP，LiCl在与RNA结合沉淀的同时，可将残余少量多酚溶解于上清液中，进而增加了所提RNA的纯度。PVP或PVPP，能够通过氢键与多酚发生络合［29］，但其功能的发挥严格取决于提取溶液的pH值，在pH＜8时，PVP高效络合多酚；当pH值≥8时，PVP或PVPP发生复性，与多酚分离。这在清除啤酒中多酚回收利用PVPP过程中多有应用［44］。目前，CTAB-LiCl法中RNA提取缓冲液pH值均≥8，这就造成PVP或PVPP无法参与植物多酚的络合反应，其改良方法尚需进一步研究。部分学者［45］在研磨植物粉样时，加入了大量的PVP或PVPP，经研磨混匀，使得PVP或PVPP充分的与细胞及多酚类物质接触，但并不能达到保护多酚类物质不受多酚氧化酶的作用，原因有以下三个方面：（1）研磨造成了植物细胞壁严重损伤，但并未对细胞内膜系统产生破坏，故多酚类物质未能高效释放；（2）PVP或PVPP只有在水溶液中才能与多酚发生氢键络合反应，并需要一定的温度条件；（3）液氮造成的局部低温，对蛋白质的功能发挥有着强烈抑制，所以多酚氧化酶不能对多酚类物质发挥作用。因此，正确看待多酚，充分了解多酚类物质的理化性质，合理使用多酚螯合剂和方法，是获得高质量RNA的重要保证。

RNA提纯去杂的过程是以牺牲其产量为前提的，如在去除多糖杂质的过程中会造成RNA大量的损失。降解、产率和纯度是RNA提取方法优劣的重要参考，但三者往往相互矛盾、相互制约。在获得RNA高产率的同时，会伴随着大量杂质，使得RNA纯度不高，即高产量的RNA其杂质含量也高，同时由于杂质的影响会使RNA出现降解现象；纯度高的RNA条带清晰锐利，不会出现降解，但是其产量很低，即大多RNA在除杂的过程中被裹挟在杂质中被同时除去。降解、产率和纯度无法同时得到解决，只能力求一个适中的方法去平衡三者的关系。

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中图分类号：Q946.2

文献标识码：A

文章编号：1001-5280（2015）01-0091-05

DO I：10.3969/j.issn.1001-5280.2015.01.22

收稿日期：2014 09- 11

作者简介：刘 芳（1988-），女，山东枣庄人，硕士研究生，Email：liupanpan1988@sina.cn。*通信作者：官春云，中国工程院院士，教授，博导，主要从事油菜遗传育种和栽培，Email：guancy2011@yaliyun.com。

Research Progress on RNA Extracting From Plants Rich in Polyphenols

LIU Fang，GUAN Chun-yun*
（College of Agronomy/National Oilseed Crops Improvement Center in Hunan，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

Abstract：Polyphenols and polysaccharide and other secondary metabolites are widely found in plants，which are susceptible to be oxidated and difficult to be separated from the nucleic acid，which results in difficult extracting of RNA.In this paper，structure and biological characteristics of polyphenolswere analyzed，the existing RNA extractionmethodswere classified，and their principle and advantages and disadvantages were evaluated.

Keywords：plant；RNA extracting；polyphenols；CTAB-LiCLmethod；SDS-phenolmethod