不同病理分级和临床分期的肾癌组织中nucleostemin mRNA的表达

张 昊，徐卫丽，武玉东，张 凯，岳俊敏，魏金星

1)郑州大学附属郑州中心医院泌尿外科 郑州 450007 2)郑州大学第一附属医院泌尿外科 郑州 450052

不同病理分级和临床分期的肾癌组织中nucleostemin mRNA的表达

张 昊1)△，徐卫丽2)，武玉东2)，张 凯1)，岳俊敏1)，魏金星2)

1)郑州大学附属郑州中心医院泌尿外科 郑州 450007 2)郑州大学第一附属医院泌尿外科 郑州 450052

△男，1979年4月生，硕士，主治医师，研究方向：泌尿系肿瘤和微创泌尿外科，E-mail：jarrybird@126.com

nucleostemin基因；肾癌

Nucleostemin蛋白是定位在肿瘤细胞核和干细胞核内的一种P53结合蛋白，可能负责对肿瘤细胞和干细胞的增殖进行相应的调控，进而阻止其分化为成熟细胞并保持细胞的扩增状态[1-3]。研究[4]发现nuleostemin基因在肾癌组织中呈现高表达状态，而在正常肾组织中未发现其表达。作者采用RT-PCR法对不同临床分期及不同病理分级的肾癌组织中nucleostemin mRNA的表达进行了检测，进一步探讨nucleostemin基因在肾癌进展中的意义。

1 材料与方法

1.1 标本 收集2003年11月至2006年1月郑州大学第一附属医院泌尿外科术中切除肾癌标本组织62例，均经病理证实。患者男35例，女27例，年龄29～78岁；透明细胞癌50例，颗粒细胞癌12例；按Thoenes病理分级，G1、G2、G3组织分别为13、27、22例；按Robson临床分期，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期分别为17、22、18和5例。患者术前均未行免疫治疗、化疗、放疗及肾动脉栓塞介入治疗。新鲜切除标本手术台边放于EP管中，液氮浸泡10 min后，保存于-80 ℃冰箱中。

1.2 Nucleostemin mRNA的RT-PCR法检测 取组织100 mg，提取总RNA，逆转录成cDNA，以此为模板，进行PCR。Nucleostemin引物上游：5’-GGATCCATGAAAAGGCCTAAGTTAAAGAAAGC-3’，下游：5’-AAGCTTGCTCTCCAAATTCTCCTTTGGTA-3’;GAPDH引物上游：5’-GGTGGACCTGACCTGC CGTCTAGA-3’，下游：5’-TTACTCCTTGGAGGCCAT GTGGG-3’;引物均订购于上海生工生物工程技术服务有限公司。扩增条件：94 ℃ 5 min预变性；94 ℃ 30 s变性, 64.5 ℃ 30 s退火, 72 ℃ 30 s延伸,循环38次。取产物10 μL加入6×Loading Dye 2 μL点样，同样点样7 μL DNA Marker，90 V电压下在20 g/L琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像系统观察电泳结果。以GAPDH为内参照。ddH2O代替cDNA为阴性参照。

1.3 统计学处理 数据经SPSS 10.0分析，不同病理分级和不同临床分期肾癌组织中nucleostemin mRNA阳性率的比较采用χ2检验或精确概率法，检验水准α=0.05。

2 结果

图1 肾癌组织中nucleostemin mRNA的表达

M：marker；N：阴性参照；1：GAPDH；2：nucleostemin cDNA片断；3：肾癌组织中阴性表达，4～5、8～12：肾癌组织中阳性表达；6～7：正常肾组织。

2.2 不同临床分期肾癌组织中nucleostemin mRNA的表达 Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期肾癌组织中nucleostemin mRNA阳性率分别为52.94%(9/17)、68.18%(15/22)、100%(23/23)，3者比较，差异有统计学意义(P<0.001)；Ⅲ～Ⅳ期组织阳性率明显大于Ⅰ期组织(P<0.001)和Ⅱ期组织(P=0.004)。

3 讨论

Nucleostemin基因在多种肿瘤细胞系，例如膀胱癌、前列腺癌、骨肉瘤、宫颈癌、肝癌、肺癌和胃癌细胞中以及一些干细胞中均有高水平的表达[5-8]，但在正常成人乳腺及肾脏细胞等已分化的细胞中未发现其表达，提示其在肿瘤细胞和干细胞这类增殖能力强的细胞中扮演着重要角色。Nucleostemin蛋白可能作为一种细胞周期检测点调控因子特异性地调控肿瘤细胞和干细胞这类高增殖细胞的复制能力[9-10]。Nucleostemin蛋白可以与GTP分离或结合以改变其在核内的活性，通过与P53蛋白分离或结合而改变细胞增殖、分化以及凋亡的过程。当这种动态平衡被打破后，就可能导致细胞周期的紊乱和细胞内环境的异常，进而引起肿瘤发生及肿瘤细胞的无序扩增发展。

既往研究[2]发现，在正常肾组织中未发现nucleostemin基因的表达；但nucleostemin基因稳定的表达于不同病理组织类型的肾癌组织中，并有着非常高的阳性率，而在各个病理类型肾癌组织中的阳性率无明显差异。Nucleostemin基因可能在肾癌细胞的增殖和自我更新中扮演重要的角色。 此次研究发现nucleostemin mRNA在肾癌组织中的表达随着病理分级和临床分期的增高而增加，中、晚期及低分化肾癌组织中的阳性率明显高于高分化和早期肾癌组织。

在尚未分化的细胞中，Nucleostemin蛋白的N端结构域与P53蛋白形成复合体，从而降低P53蛋白诱导细胞凋亡和调控细胞周期的功能，导致受损细胞的DNA无法修复，帮助细胞通过检测点顺利进入细胞周期，增加细胞癌变的机会。细胞进入分化期以后， nucleostemin基因在细胞的表达迅速下调，Nucleostemin蛋白与P53蛋白形成的复合体解离，释放出P53蛋白重新调控细胞周期，而细胞分化成熟后，nucleostemin基因就停止了表达[1,7]。说明nucleostemin基因在分化差的细胞表达的更高，其基因表达和细胞分化情况有着紧密的联系，所以其表达的强度可以作为评判肿瘤恶性程度的指标，这与该研究的结果相一致。通过改变nucleostemin的活性可能对肾癌起到一定的防治作用。

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(2014-08-22 收稿 责任编辑王 曼)

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.035