胃癌组织中CD44v6、MMP-9蛋白的表达

2015-04-18王水生赵春临丁朝辉徐化楠叶延伟

郑州大学学报（医学版） 2015年3期

关键词：淋巴结胃癌阳性

王水生,赵春临，丁朝辉，徐化楠，叶延伟

郑州大学第一附属医院胃肠外科郑州 450052

胃癌组织中CD44v6、MMP-9蛋白的表达

王水生,赵春临#，丁朝辉，徐化楠，叶延伟

郑州大学第一附属医院胃肠外科郑州 450052

#通信作者，男，1966年1月生，博士，主任医师，副教授，研究方向：消化道肿瘤基础与临床，E-mail:zhaochunlin@zzu.edu.cn

胃肿瘤；CD44v6；MMP-9；浸润转移

胃癌是消化系统中常见的恶性肿瘤,其发病率呈逐年上升趋势。恶性肿瘤的侵袭和转移是引起患者死亡的主要原因，然而肿瘤侵袭和转移是个多步骤多基因参与的复杂过程，涉及细胞与细胞外间质或与其他细胞的一系列相互作用。有研究[1-2]表明，黏附分子 CD44拼接变异体v6(CD44 splice variant v6，CD44v6)的过度表达及基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)活性和表达的增强与胃癌浸润、转移及预后密切相关。作者运用免疫组化SP双染技术检测CD44v6和MMP-9蛋白在60例原发性胃癌及60例正常胃黏膜组织中的表达,探讨其在胃癌浸润、转移中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料收集郑州大学第一附属医院2013年3月至2014年3月期间收治的胃癌根治手术患者60例，所有病例手术前均未曾接受过放化疗、中医及免疫治疗。患者男32例，女28例；年龄42～75岁，<60岁29例，≥60岁31例；肿瘤直径≥3 cm 18例，<3 cm 42例；浸润深度：T0、16例，T231例，T3、423例；淋巴结转移：N04例，N1、236例，N3、420例；TNM分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期29例，Ⅲ期25例。

1.2 取材及制片所有标本取材均在手术中标本离体后30 min内完成，每例手术标本均取癌灶组织和癌旁正常胃组织各2块，每块300～500 mg，无菌生理盐水冲洗，滤纸吸干后装入无酶EP管并立即投入液氮中，随后转至-70 ℃低温冰箱中保存备用。

1.3 CD44v6和MMP-9蛋白的免疫组化SP双染法检测所有标本用甲醛固定，脱水，然后石蜡包埋，最后4 μm厚连续切片。实验前加做抗体交叉实验，未见交叉反应。严格参照说明书染色，混合一抗(稀释200倍使用)，孵育条件为4 ℃过夜，并高压蒸汽修复，以pH 6.0柠檬酸缓冲液作为抗原修复液，混合二抗(稀释100倍使用)。阴性对照使用PBS代替一抗染色，以公司提供的已知阳性片作为阳性对照。CD44v6单克隆抗体、MMP-9多克隆抗体及Polymer双染试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4 结果判断 CD44v6和MMP-9的阳性染色呈棕黄色及红色颗粒或团块状，CD44v6主要表达于细胞膜，少数可见于胞质;MMP-9主要在近膜胞质中表达。由两位病理医师分别观察，每张切片选取3个具有代表性的高倍视野(×400)，计数100个细胞，根据染色程度以及阳性细胞百分比进行评分。①染色程度:不着色为0分，着色淡为1分，中度着色为2分，着色深为3分。②阳性细胞百分比：<5%为0分， 5%～为1分， 25%～为2分，50%～为3分。两者相乘为最后得分，0～1分为阴性(-)，2～3分为(+)，4～6分为()，>6分为()。

1.5 统计学处理采用SPSS 16.0分析。用配对χ2检验比较胃癌及癌旁正常胃组织中CD44v6 和MMP-9蛋白表达的差异，应用χ2检验分析胃癌组织中CD44v6和MMP-9蛋白的表达与胃癌患者临床病理特征的关系，应用Spearman相关分析胃癌组织中两种蛋白表达的关系，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 胃癌组织及癌旁正常胃组织中CD44v6与MMP-9蛋白的表达胃癌组织中CD44v6主要定位于细胞膜和近膜的胞质(图1 )，呈异质性表达，胃癌组织中CD44v6蛋白阳性表达率81.67%(49/60)，高于癌旁正常胃组织阳性表达率为15.00%(9/60) (表1)。MMP-9阳性表达产物在胃癌组织细胞中主要定位于细胞质，在60例胃癌组织中阳性表达率为73.33%(44/60)，在癌旁正常胃组织中阳性表达率为5.00%(3/60)(表2)。胃癌组织中CD44v6和MMP-9蛋白阳性表达率均高于癌旁正常胃组织。

图1 胃癌组织中CD44v6(A)和MMP-9(B)的表达(SP双染, ×400)

表1 胃癌及癌旁正常胃组织中CD44v6蛋白的表达例

表2 胃癌及癌旁正常胃组织中MMP-9蛋白的表达例

2.2 胃癌组织中CD44v6与MMP-9蛋白的表达与胃癌患者临床病理学特征的关系见表3。

表3 CD44v6与MMP-9蛋白的表达与胃癌临床病理学特征的关系例(%)

2.3 胃癌组织中CD44v6与MMP-9蛋白表达的关系胃癌组织中CD44v6与MMP-9蛋白的表达呈正关联，见表4。

rS=0.036，P=0.009。

3 讨论

恶性肿瘤的侵袭和转移是引起患者死亡的主要原因，然而肿瘤侵袭和转移是个多步骤多基因参与的复杂过程，其中细胞黏附、基质溶解和细胞移动是癌细胞侵袭、转移过程中的3个步骤[3]。

CD44是由单一基因编码的单链膜表面糖蛋白家族，具有高度异质性，基因定位于第11号染色体短臂上[4],CD44v6是CD44家族中的一种变异形，它能与透明质酸结合，通过影响肿瘤细胞与基质的结合从而改变肿瘤细胞的浸润及转移能力。该研究结果发现胃癌组织中CD44v6蛋白的表达均高于正常胃组织;CD44v6在胃癌组织中的表达与胃癌浸润深度及TNM分期密切相关，但与年龄、性别、淋巴结转移、肿瘤的大小及生长位置无关。Okayama等[5]发现在胃腺癌组织中CD44v6阳性表达率明显高于其在非典型增生胃黏膜及正常胃黏膜中的表达率，随着肿瘤细胞浸润深度的增加、淋巴结转移，CD44v6阳性表达率显著升高，但与年龄、性别及有无脉管侵犯无关。CD44v6强阳性表达的胃癌患者术后生存率均明显降低，表明胃癌CD44v6的过度表达可能使胃癌细胞产生侵袭表型，以利于癌细胞的转移[2]。该研究结果与以上结果基本相符，即胃癌的浸润深度及TNM分期与CD44v6的表达有关，说明CD44v6确实在胃癌浸润中扮演着重要的角色。

MMP-9是MMPs中的重要成员，能降解细胞外多种基质成分，其中就包括基底膜的主要成分Ⅳ型胶原[6]。肿瘤细胞表达MMP-9与其侵袭转移能力有关[7]。Littlepage等[8]报道MMP-9参与了肿瘤新生血管的生成，新生微血管在结构上不完善，缺乏肌层，基膜不连续，这些结构特点丧失了组织对肿瘤侵犯的屏障作用，增加了肿瘤进入淋巴、血液循环的可能。有研究[9]表明MMP-9的表达和活性随乳癌分级的增加而增高。对于胃癌既往研究[10]显示，MMP-表达与胃癌浸润深度、淋巴结转移、病期密切相关，MMP-9强阳性表达者术后生存率显著下降，提示MMP-9表达与胃癌的发展及预后密切相关，而MMP-9强阳性表达常常意味着胃癌病期较晚[2]。以上结果一定程度上说明了MMP-9在胃癌恶性生物学行为中发挥着重要的作用，其中在淋巴结转移方面的结果与该实验结果不完全一致。然而也有学者[11]表明MMPs在淋巴结转移过程中的作用尚无统一结论。该研究有无淋巴结转移患者MMP-9蛋白的表达未见显著差异，原因可能有：①无淋巴结转移的样本量偏少。②胃癌特殊的“跳跃式”淋巴结转移方式。

该研究结果显示胃癌组织中CD44v6和MMP-9蛋白表达有关联。以往有研究[12]表明CD44v6有利于MMP-9锚定在细胞膜表面，通过影响细胞内骨架蛋白的构型和分布从而介导肿瘤浸润和转移。该研究结果与以上理论相符，可以推断出CD44v6与MMP-9在胃癌浸润转移过程中相互关联、协同作用。因此，联合检测两者对胃癌治疗的临床实践具有一定的指导意义，即对两者表达均阳性的患者应采取更积极的治疗措施。

[1]张成武,徐文娟,赵仲生,等.CD44V-6和E-CD的表达与胃癌生物学特性的关系[J].中华普通外科杂志,2000,15(4):4

[2]张成武,邹寿椿,徐文娟,等.胃癌基质金属蛋白酶-9表达的临床意义[J].中国胃肠外科杂志,2000,3(1):25

[8]Littlepage LE,Sternlicht MD,Rougier N,et al.Matrix metalloproteinases contribute distinct roles in neuroendocrine prostate carcinogenesis, metastasis, and angiogenesis progression[J].Cancer Res,2010,70(6):2224