不同时期铅暴露对小鼠学习记忆能力及海马组织中β淀粉样蛋白表达的影响*

李 静，刘芳丽，安伟锋，薛振菲，李文杰#

1)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001 2)河南大学护理学院 开封 475004 3)河南省疾病预防控制中心健康教育与慢病防治研究所 郑州 450001 4)北京西城区陶然亭社区卫生服务中心 北京 100052

不同时期铅暴露对小鼠学习记忆能力及海马组织中β淀粉样蛋白表达的影响*

李 静1)，刘芳丽2)，安伟锋3)，薛振菲4)，李文杰1)#

1)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001 2)河南大学护理学院 开封 475004 3)河南省疾病预防控制中心健康教育与慢病防治研究所 郑州 450001 4)北京西城区陶然亭社区卫生服务中心 北京 100052

#通信作者,男，1958年11月生，教授，研究方向：营养及相关疾病，E-mail：lwj@zzu.edu.com

铅；小鼠；学习记忆能力；β淀粉样蛋白

目的：探讨不同时期铅暴露对小鼠学习记忆能力以及海马组织中β淀粉样蛋白(Aβ)表达的影响。方法：将40只健康雄性仔鼠随机分为生长期暴露组[母鼠饮2 g/L的醋酸铅水溶液经母乳给仔鼠染毒，直至断乳(21 d)]、成年期暴露组(出生后第180～240天给予2 g/L的醋酸铅水溶液)、共同暴露组(按照上述方式在生长期及成年期均染铅)以及对照组(饮用去离子水)4组，每组10只。1 a后，分别用Morris水迷宫及ELISA测定各组小鼠的学习记忆能力以及海马组织中Aβ含量。结果：各组小鼠平均逃避潜伏期差异有统计学意义(F时间=396.688，F组间=177.902，P均<0.001)；各暴露组小鼠穿越平台次数少于对照组(F=30.394,P<0.001)，生长期暴露组和共同暴露组小鼠穿越平台的次数少于成年期暴露组(P均<0.05)；各暴露组小鼠海马组织中Aβ含量高于对照组(F=346.032和53.796,P均<0.001)，且生长期暴露组和共同暴露组Aβ含量高于成年期暴露组(P<0.05)。结论：生长期铅暴露造成海马组织中Aβ蓄积更严重，小鼠学习记忆能力的损害也更严重。

环境铅暴露可增加阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)的发生风险，其致病机制尚未完全阐明[1]。β淀粉样蛋白(β-amyloid protein，Aβ)是AD脑内主要病理标志性蛋白之一，它的形成、沉积和降解是AD整个病理过程的关键因素[2-3]。研究[4]表明，Aβ具有神经毒性，可引起神经突触功能障碍以及神经元丢失，进而导致认知功能受损，被认为是AD的致病“元凶”。铅对神经系统的影响与暴露年龄、暴露周期均相关[5-6]。为进一步明确铅暴露时期对神经系统损伤的可能机制和结局，作者对生长发育期、成年期2个生命阶段的小鼠进行染毒，观察2组小鼠学习记忆能力和脑组织中Aβ含量的变化，探讨铅暴露时期在AD病变过程中的可能作用。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器 醋酸铅(洛阳市化学试剂厂)，水合氯醛(天津市科密欧化学试剂有限公司)，肝素钠(国药集团化学试剂有限公司)，Aβ1-40和Aβ1-42酶联免疫分析试剂盒(美国IBL公司)，Morris水迷宫(北京硕林苑科技有限公司)，Z-5000石墨炉原子吸收光谱仪(日本日立公司)，Bio-Rad 680型全自动酶标仪(美国伯乐公司)，超声波细胞破碎仪(上海京工实业有限公司)。

1.3 小鼠学习记忆能力的测定 所有实验小鼠接受铅暴露后饲养至出生后的第360天，用Morris水迷宫测试小鼠学习记忆能力。Morris水迷宫测试包括定位航行试验(测试的第1～6天)和空间探索实验(测试的第8天)。将小鼠头朝池壁放入水中，从小鼠入水开始，记录其找到目标平台并在平台上停留3 s 后的时间(即逃避潜伏期)。训练过程中设置记录时间为60 s，若小鼠在此时间内找不到平台，则由实验者将其放上平台适应10 s。每只小鼠训练4 次/d，连续训练4 d。最后一次训练结束后的第2天，按照训练方法测试其逃避潜伏期，若在60 s 内未找到平台，潜伏期记录为60 s，取4 次结果的平均值，连续测定5 d。间隔1 d，第7天撤除平台，任选一个入水点将小鼠放入水中，测量小鼠在60 s内穿越原目标平台的次数[7-8]。

1.4 小鼠海马组织中Aβ1-40和Aβ1-42含量的测定 学习记忆能力测试完成后次日，禁食水，称量小鼠体重，按照0.3 mL/100 g注射100 g/L水合氯醛溶液麻醉，断头处死小鼠，剥离脑组织，用冰生理盐水冲洗后，冰上快速分离出海马组织，液氮速冻，放于-80 ℃冰箱保存。称取海马组织100 mg，加入500 μL预冷的PBS缓冲液于离心管中，放入冰盒中超声破碎匀浆(变幅杆频率设置为3次/s，定时2 min)，破碎后的匀浆液4 000 r/min离心，取上清，用ELISA试剂盒测定Aβ1-40和Aβ1-42含量。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0进行分析，应用重复测量数据的方差分析比较各组小鼠平均逃避潜伏期的差异，应用单因素方差分析和LSD-t检验比较各组小鼠穿越平台次数、海马组织中Aβ1-40和Aβ1-42含量的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组小鼠平均逃避潜伏期的比较 见表1。各组小鼠不同测定时间的平均逃避潜伏期差异有统计学意义，不同组别间差异有统计学意义。

表1 各组小鼠平均逃避潜伏期的比较 s

F时间=396.688，P<0.001；F组间=177.902，P<0.001；F交互=3.194，P=0.004。

2.2 各组小鼠穿越平台次数、海马组织中Aβ1-40和Aβ1-42含量的比较 见表2。

表2 各组小鼠穿越平台次数、海马组织中Aβ1-40和Aβ1-42含量的比较

*：与对照组比较，P<0.05；△：与成年期暴露组比较，P<0.001；#：与生长期暴露组比较，P<0.05。

3 讨论

在该实验中，考虑到雌性小鼠发育成熟后，尤其是发情期，体内雌激素水平会有较大程度的提高，而雌激素对神经系统有明确的保护作用[9-10]，为了排除这种保护作用的影响，故只选择雄性小鼠作为实验动物。另外该研究不考虑铅暴露的剂量效应关系，重在观察固定铅暴露剂量时不同铅暴露时期对相应指标的影响，故单一选择了2 g/L的醋酸铅水溶液作为染铅剂量。

Morris水迷宫测试结果显示：与对照组相比，各铅暴露组小鼠的学习记忆能力均有所下降，说明铅暴露会对小鼠的学习记忆能力造成损伤，这与以往的研究[11-12]结果相一致。同时该研究结果还显示：生长期铅暴露对小鼠空间学习记忆能力的影响比成年期铅暴露更严重，提示大脑发育早期的铅暴露可能会对小鼠的学习记忆能力产生更为严重的影响。

不同神经发育阶段的铅暴露对神经系统的毒性不同，脑发育阶段与成熟阶段相比，对铅暴露更为敏感。Goyer[13]发现当铅染毒剂量和染毒时间相同时，胎儿期大鼠脑铅含量比成年大鼠增加10倍，哺乳期大鼠增加3.5倍，而断乳期大鼠仅增加2倍，说明脑发育期的铅暴露更容易造成铅在脑组织中的蓄积，而这种蓄积会对其学习记忆功能造成损害。

该研究结果显示：与对照组相比，不论是哪个时期的铅暴露，均会造成小鼠海马组织中Aβ含量的升高，生长期铅暴露的作用更显著，提示在脑发育早期的铅暴露更容易引起海马组织中Aβ的蓄积。

有研究[14]发现铅在脉络丛中的蓄积导致了大脑中Aβ含量的显著提高，继而对神经系统造成损伤。Basha等[15]研究发现大鼠生长发育期铅暴露后，淀粉样前体蛋白(APP)基因在幼鼠脑内短时期诱发表达，在终止暴露20个月后再次发现APP高表达现象，并伴随APP蛋白及其产物Aβ表达的上调；而晚期铅暴露大鼠的上述基因和蛋白并无改变。有研究[16]发现脑发育期的铅暴露可干扰随后生命过程中APP的表达，进而影响体内Aβ的含量。由此可见，发育期的铅暴露会引起海马组织中Aβ含量的上升，但该研究结果只观察了不同发育阶段的小鼠在12月龄这一时间点的Aβ含量，Aβ水平升高的具体机制以及学习记忆能力的损伤是否与Aβ的蓄积存在关系尚有待进一步研究。

综上所述，铅暴露会导致小鼠海马组织中Aβ的蓄积以及学习记忆能力的损害，且生长期的铅暴露造成的蓄积更严重，对小鼠学习记忆能力的损害也更严重。这也提示儿童在生长发育期要远离铅暴露，避免因接触铅而对身体健康造成损害。

[1]Bakulski KM,Rozek LS,Dolinoy DC,et al.Alzheimer′s disease and environmental exposure to lead: the epidemiologic evidence and potential role of epigenetics[J].Curr Alzheimer Res,2012,9(5):563

[2]唐伟,张营丽,王威.阿尔茨海默病发病机制的研究进展[J].医学与哲学,2014,35(1B):49

[3]陈培,牛莹莹,杨晓帆.阿尔茨海默病发病中淀粉样β蛋白的神经毒性作用[J].中国药物经济学,2014(2):205

[4]Lichtenthaler SF.α-secretase in Alzheimer′s disease: molecular identity, regulation and therapeutic potential[J].J Neurochem,2011,116(1):10

[5]于德娥,魏青,陈易林,等.不同神经发育阶段铅暴露对大鼠海马神经元数目的影响[J].中国卫生检验杂志,2011,21(11):2654

[6]刘芳丽.生命早期铅暴露在阿尔茨海默病样变进程中的作用及分子机制[D].郑州:郑州大学,2014.

[7]李莹,张楠,刘芳丽,等.白藜芦醇对铅暴露小鼠学习记忆能力及氧化应激相关因子的影响[J].郑州大学学报:医学版,2013,48(3):327

[8]宿艳敏.Morris水迷宫试验中三种小鼠的学习记忆能力及其性别差异[D].石家庄:河北医科大学,2013.

[9]马敏,李斌.雌激素对阿尔茨海默病神经保护的作用机制[J].中国实用妇科与产科杂志,2014,30(4):316

[10]沈丽霞,张力.雌激素神经保护作用研究进展[J].神经药理学报,2012,2(3):29

[11]彭博,游园园,孙黎光.铅暴露导致小鼠学习记忆功能障碍及海马蛋白激酶B表达降低[J].中国药理学与毒理学杂志,2012,26(6):801

[12]陈灿映,冯静,刘芳丽,等.孕哺期铅暴露对仔鼠学习记忆能力及海马组织中P-JNK表达的影响[J].郑州大学学报:医学版,2012,47(1):78

[13]Goyer RA.Results of lead research:prenatal exposure and neurological consequences[J].Environ Health Perspect,1996,104(10):1050

[14]Behl M,Zhang Y,Monnot AD,et al.Increased beta-amyloid levels in the choroid plexus following lead exposure and the involvement of low-density lipoprotein receptor protein-1[J].Toxicol Appl Pharmacol,2009,240(2):245

[15]Basha MR,Wei W,Bakheet SA,et al.The fetal basis of amyloidogenesis: exposure to lead and latent overexpression of amyloid precursor protein and beta-amyloid in the aging brain[J].J Neurosci,2005,25(4):823

[16]Bolin CM,Basha R,Cox D,et al.Exposure to lead and the developmental origin of oxidative DNA damage in the aging brain[J].FASEB J,2006,20(6):788

(2014-09-10 收稿 责任编辑赵秋民)

Effects of lead exposure on learning and memory ability and β-amyloid protein level in hippocampus of mice at different age stages

LIJing1)，LIUFangli2)，ANWeifeng3)，XUEZhenfei1)，LIWenjie1)

1)DepartmentofNutritionandFoodHygiene，CollegeofPublicHealth，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450001 2)SchoolofNursing，HenanUniversity,Kaifeng475004 3)InstituteofHealthEducationandChronicDiseasePrevention，DiseasePreventionandControlCenterofHenan，Zhengzhou450001 4)XichengDistrictTaorantingCommunityHealthServiceCenterofBeijing,Beijing100052

lead；mouse；learning and memory ability；β-amyloid protein

Aim: To explore the effects of lead exposure on the ability of spatial learning and memory and β-amyloid protein(Aβ) level in hippocampus of mice at different age stages. Methods: Healthy male mice were randomly allocated into growing exposure group(drinking 2 g/L Pb containing water from birth to 21 days by breast milk), adulthood exposure group(drinking 2 g/L Pb containing water from 180 days to 240 days after birth), joint exposure group(lead exposed at growing period and adulthood) and control group(drinking deionized water), 10 mice in each group. After 1 year, the spatial learning and memory ability was evaluated by Morris water maze (MWM), and the level of Aβ in hippocampus was measured by ELISA. Results: The escape latency in each group measured at different days had significant difference(Ftime=396.688，P<0.001), and there were also differences between different groups(Fgroup=177.902，P<0.001). And compared with the control group, the numbers of platform cross significantly decreased(F=30.394,P<0.001). The numbers of platform cross in the growing exposure group and the joint exposure group were less than the adulthood exposure group(P<0.05). The level of Aβ in hippocampus in lead exposure groups were significantly higher than that in control group(F=346.032 and 53.796,P<0.001), and the levels of Aβ in both the growing exposure group and the joint exposure group was higher than that in the adulthood exposure group(P<0.05). Conclusion: Lead exposure can lead to the accumulation of Aβ in hippocampus and the damage of spatial learning and memory ability. These accumulation and damage are more severe when the mice get lead exposure in growing time.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.004

*国家自然科学基金资助项目 81172716

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