开设“流式细胞术”实验课 提高研究生实践能力

张 英， 李 莉， 任林柱， 郝林琳， 杨 举， 张丽颖， 黎宏宇

(吉林大学 a. 动物科学学院； b. 动物医学学院; c. 人力资源与社会保障处, 吉林 长春 130062)



开设“流式细胞术”实验课 提高研究生实践能力

张 英a， 李 莉a， 任林柱a， 郝林琳a， 杨 举b， 张丽颖a， 黎宏宇c

(吉林大学 a. 动物科学学院； b. 动物医学学院; c. 人力资源与社会保障处, 吉林 长春 130062)

流式细胞术是一门新兴的实验科学技术，广泛应用于基础研究与临床检测等领域。根据科研的需要，面向兽医学相关专业的研究生开设了流式细胞术的实验课，帮助学生深入了解了流式细胞仪的工作原理、操作方法及应用。课程中设置了“PLA2G7-EGFP质粒转染ECA-109细胞与PK-15细胞后EGFP蛋白的表达”和“小鼠外周血单个核细胞(PBMC)的分离及B细胞的检测”两个教学范例。在课程中让学生亲自参与样本的制备，包括细胞的培养与转染、小鼠外周血的采集、单细胞悬液的制备、细胞染色、样本过滤、流式样本的上机操作、数据的获取与分析等，培养了学生的动手能力及独立操作机器的能力。并与研究生以后的科研实验相结合，提高了学生独立思考、分析问题、解决问题的能力，帮助研究生在未来的实验研究中科学规划和使用流式细胞仪。

流式细胞术； 兽医学； 研究生； 实验教学

0 引 言

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是20世纪70年代发展起来的高科学技术，是一项对被荧光素染色的生物颗粒如各种单细胞、微生物及各种人工微球等，在激光照射高速流动状态下，对其进行多参数、快速定量分析，以及对特定群体进行分选的现代细胞分析新技术，具有很强的实践性和技术性。在医学高等院校及科研机构中应用越来越普遍，随着流式细胞术的不断发展与完善，应用领域已从细胞生物学、发育生物学、微生物学等基础研究扩大到肿瘤学、药物性、血液学、临床检验等各个方面[1-3]。

兽医学院的研究生主要研究方向有生物化学与分子生物学、发育生物学、胚胎生物学、预防兽医学、临床兽医学、基础兽医学等，根据学院的科研需求，吉林大学农学部购进一台美国BD公司，型号为AriaⅡ的流式细胞仪，并在研究生的分子遗传学实验课教学课程中率先开设了流式细胞术实验课，帮助学生了解了FCM的基本原理及应用领域，拓宽了科研思路，提高了科研实践能力和综合素质。

1 流式细胞仪

1.1 工作原理

流式细胞仪是一种综合了激光技术、半导体技术、流体力学、光电测量技术等各学科的知识为一体的大型精密仪器。其主要由流动室与液流驱动系统，激光光源与光束形成系统，信号检测、存贮、光电转换、数据处理系统以及细胞分选系统5部分组成[4]。

将单细胞悬液样本，经不同的荧光染料染色后置于流式管中，样本在一定的压力下进入流动室，在鞘液的的包裹下成单行排列，并以一定流速经过喷嘴通过激光聚焦区，在激光束的照射下，产生荧光信号和散射光信号。光信号通过波长选择通透性滤片后，经PMT接收转化为电信号，再经模/数转换器，转换为能被计算机识别的数字信号，计算机对采集的各种信号用相应的软件进行分析处理，以一维直方图、二维、三维散点图或等高线图及数据表等形式显示出来[3]。散射光信号包括前向角散射光(Forward Scatter，FSC)及侧向角散射光(Side Scatter，SSC)。FSC主要反映细胞大小，SSC主要反映细胞膜、细胞质、核膜的折射情况及细胞内颗粒的复杂程度。荧光信号的强弱反映了细胞内物质浓度或者所测细胞表面抗原的强度大小。

1.2 机型介绍

流式细胞仪根据其功能主要分为临床分析型流式细胞仪和科研分选型流式细胞仪两种。分析型流式细胞仪包括美国BD公司生产的FACS Calibur，FACS Count，FACS Canto II ，FACS Verse；以及美国Beckman Coulter公司生产的Epics XL，FC 500，Gallios，CyAn流式细胞仪等，只能用于流式分析，其自动化程度高，易学易掌握，主要用于临床实验检测，样本被分析后最终进入废液桶；分选型流式细胞仪包括FACSVantage SE，FACSAria I(II/III)，Influx及MoFlo XDP等，既可用于分析又可进行分选，其功能齐全，应用灵活，能够分选回收样品细胞内的目标细胞，用于后续功能试验，如PCR、FISH或继续培养等。

2 流式细胞术的应用

在了解流式细胞仪的基础上，介绍流式细胞术的应用。FCM既可以检测细胞结构包括：测量细胞的大小、细胞内颗粒的复杂程度、核浆的比例、细胞表面积、DNA含量、RNA及蛋白质含量；也可以检测细胞功能包括：细胞表面及胞浆的特异性抗原、细胞因子、细胞活性、激素结合位点、细胞受体等。随着单克隆抗体技术、荧光化学等技术的发展，该技术作为一种快速细胞分析技术，应用领域日益扩展，越来越广泛地应用于免疫学、兽医微生物学、细胞学、肿瘤学及临床实践的各方面。包括淋巴细胞及其亚群测定、细胞凋亡及细胞周期、淋巴细胞功能检测、细胞因子检测、RNA测定、总蛋白测定、白血病免疫分型、HIV检测、牛奶及化妆品中病原微生物的检测、水质检测等[5-6]。在讲解过程中，根据本学院研究生的科研方向，利用大量的流式细胞仪分析图谱，重点讲述流式细胞术在兽医基础医学、预防医学、临床医学及动物干细胞研究领域的中应用，主要包括细胞因子检测、细胞周期、细胞凋亡、淋巴细胞检测等实验。使学生能够更加直观、生动、通俗易懂地了解流式细胞术的应用。

3 实验课程的设计

3.1 理论知识

流式细胞术实验课课程设置20学时，理论知识讲解4学时、仪器培训4学时、流式样品制备及上机操作12学时。目前，利用国家级动物科技实验教学示范中心平台，已制作完成了“流式细胞术原理、操作与技巧”视频，结合多媒体课件，主要讲述流式细胞术原理、常用概念如通道、门等，FCM数据存储、显示与分析、样品的制备过程、荧光染料的选择与使用、对照的设置、光谱重叠与补偿调节及在操作过程中的具体注意事项等[7-8]。

3.2 仪器操作

FACSAria II是科研分选型流式细胞仪，较临床机复杂。在实验开始前，组织学生进入实验室进行观摩学习。结合仪器培训时的DV视频，重点讲解流式细胞仪的结构组成及在系统中发挥的作用、仪器的开机程序及注意事项、FACS Diva Software软件的使用方法、仪器的保养与维护、关机程序及注意事项等。并利用BD公司培训用的荧光微球先由教师示范流式样本的上机操作过程及如何分析实验结果，然后学生在老师的指导下独立练习仪器的使用方法，确保学生在实验前对仪器有充分的了解和掌握。

3.3 流式细胞样品分析

结合研究生的科研需要，设计两个实验内容：① PLA2G7-EGFP质粒转染ECA-109细胞与PK-15细胞后EGFP蛋白的表达；② 小鼠脾脏T淋巴细胞亚类(CD3、CD4、CD8)检测的实验。

3.3.1 仪器、试剂与材料

生物安全柜，流式细胞仪，倒置显微镜，水平离心机，二氧化碳培养箱，细胞计数板，移液器(200 μL 、1 mL)，1640培养基，DMEM(Hyclone)；PLA2G7-EGFP质粒(实验室构建)，ECA-109细胞及PK-15细胞(实验室保存)，脂质体2000， PI(500 ug/mL)，FITC - Anti-Mouse CD19(BD公司)，动物外周血淋巴细胞分离液，昆明鼠。

3.3.2 实验方法

实验1：PLA2G7-EGFP质粒转染ECA-109细胞与PK-15细胞后EGFP蛋白的表达(4学时)。

(1) 转染细胞的准备：提前1天将ECA-109细胞及PK-15细胞用无抗生素培养液接种到12孔细胞培养板中，细胞密度达到70%左右即可进行转染实验。

(3) 转染准备：细胞用1 mL无血清培养液漂洗一次，再加入300 μL无血清培养液。

(4) 转染：取A/B混合液15 μL缓慢加到12孔板中，摇匀，37℃培养4 h后，更换10 % DMEM培养液继续培养。

(5) 转染24 h后，胰酶消化，收获细胞，PBS漂洗一次，并重悬于PBS中，密度为5×105～1×106cells/mL。

(6) 流式检测，阴性对照为未转染质粒的ECA-109细胞及PK-15细胞。

实验2：小鼠外周血单个核细胞(PBMC)的分离及B细胞的检测(8学时)。

(1) 小鼠摘除眼球采血，置于肝素抗凝的1.5 mL离心管中，用等体积的PBS稀释全血。

随着我国城市化进程不断加快，城市基础设施和公共设施需求增长强劲，地方政府作为主要投资主体在很长一段时间内承担了大量的城市建设和投资任务.很多地方政府在自身财力不够的情况下四处举债，承受了巨大的资金压力和还贷风险.为了扼制这种势头，进入新世纪尤其是2002年以后，国家出台了一系列的政策法规，特别是《预算法》中明文规定，不允许地方政府直接举债和提供担保.在这种大趋势下，作为地方政府对外政策性投融资平台的各类城市建设投资公司(下称城投公司)应运而生.

(2) 在5 mL的离心管中加入一定量的淋巴细胞分离液，将稀释后的血液加到分离液的上方，室温，2 000～2 500 r/min离心20～30 min。

(3) 离心结束后，将血浆层与分离液层之间的较薄较致密的白膜层吸到另一个离心管中，用PBS/1640稀释，混匀，1 000～1 500 r/min离心5～10 min，重复1到2次。

(4) 细胞计数，用100 μL PBS将淋巴细胞重悬，调整细胞浓度至2×106cells/mL。

(5) 加入10 μL FITC - Anti-Mouse CD19(0.25 mg/mL)。

(6) 4℃，避光孵育30min。

(7) 离心去上清， PBS/BSA 洗细胞2～3次，用200 μL PBS将淋巴细胞重悬，加入4 μL PI染料(500 μg/mL)，孵育5～10 min。

(8) 相同方法，分别制备空白管和各染色抗体单染对照管及实验组样本管。

(9) 流式上机检测。

3.3.3 结果与分析

实验1 PLA2G7-EGFP质粒转染ECA-109细胞与PK-15细胞后EGFP蛋白的表达。

绿色荧光蛋白(GFP)是一种天然荧光蛋白，它在细菌、真菌、动物细胞中表达时能够发出绿色荧光，是一种比较理想的荧光标记蛋白。增强型绿色荧光蛋白(EGFP)是在野生型GFP的基础上对其基因进行改造，显著提高了其在动物细胞中的荧光效能，大大增强了该报告分子的灵敏度，使EGFP非常适用于流式细胞术(FCM)分析[9-11]。为确定脂质体转染法在不同细胞中的转染效率，分别将含有报告基因EGFP的质粒PLA2G7-EGFP转染ECA-109细胞与PK-15细胞。结果表明，转染后ECA-109细胞中荧光信号强度(46.1%)明显高于PK-15细胞(14.6%)。图1、图3为FSC-SSC物理参数图，确定待检测的细胞群；图2、图4为EGFP单参数直方图(峰图)，“P2”门为表达EGFP阳性细胞的情况。

图1 PK-15 FSC-SSC 物理参数图

图2 EGFP转PK-15 单参数直方图

图3 ECA-109 FSC-SSC 物理参数图

图4 EGFP转ECA-109 单参数直方图

实验2 小鼠外周血单个核细胞(PBMC)的分离及B细胞的检测。

小鼠血液中各种成分的比重存在差异，利用接近等渗的ficoll-hypaque混合溶液(又称淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新聚集。外周血单个核细胞密度略低于分层液，故位于分层液界面之上，这样就可获得PBMC。细胞表面抗原CD19在正常及恶性B淋巴细胞中均有表达，是B细胞发育过程中一个涵盖阶段较长的最为可靠的表面标记物。CD19+B淋巴细胞比例的变化反映机体的免疫状态，外周血中CD19+B淋巴细胞比例的降低可能由很多原因引起，包括CD19+B淋巴细胞生成异常，破坏或丢失增加及迁徙的异常[12-15]。并利用PI染料鉴定获得的淋巴细胞的细胞活力情况。

图5 淋巴细胞 FSC-SSC物理参数图

图6 FITC / PI 双参数散点图

图7 分析结果统计图

在上述两个实验过程中，学生亲自参与样本的制备，包括细胞的培养与转染、小鼠外周血的采集、单细胞悬液的制备、细胞染色、样本过滤、流式样本的上机操作、数据的获取与分析等，培养了学生的动手能力及独立操作机器的能力，让学生更好的理解和掌握流式细胞术的原理与应用。

4 结 语

流式细胞术是一门新兴的实验科学技术,，在兽医学院研究生实验教学方面开设此实验课是一个新的尝试。通过两年的实践，学生反馈情况良好。既提高了大型贵重仪器的利用率，也调动了学生的学习热情，锻炼了学生动手操作的能力，更好地理解和掌握流式细胞术的原理与应用，实现了教学和科研的有机结合。在教学中激发了学生的探索和实践能力，使学生真正能把这门技术运用于自己的课题研究之中。

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Setting Flow Cytometry Experiment Lesson to raise Graduates’ Practice Ability

ZHANGYinga,LILia,RENLin-zhua,HAOLin-lina,YANGJub,ZHANGLi-yinga,LIHong-yuc

(a. College of Animal Science; b. College of Veterinary Medicine; c. Human Resources and Social Security,Jilin University, Changchun 130062, China)

Flow cytometry is an emerging experimental science and technology, widely used in basic research and clinical testing and other scopes. According to research related to veterinary science-oriented graduate students, flow cytometry laboratory sessions were opened to help students understand the working principle of the flow cytometer, methods of operation and application. Two teaching courses "PLA2G7-EGFP plasmid expressing EGFP protein ECA-109 after PK-15 cells" and "detecting peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and B cells isolated" were set up. In the curriculum, students were involved in the preparation of samples, including cell culture and transfection, mouse peripheral blood collection, preparation of single cell suspensions, cell staining. The sample was filtered stream samples machine operation, acquired data and analysis. It trained the students' practical ability and the ability to operate independently of the machine. Base on these lessons, experimental research and graduate ability later was combined to improve the students in thinking independently, and enhance their analyzing problems, problem-solving skills. It also helps students to use scientific planning and study of flow cytometry experiments in the future.

Flow cytometry; veterinary; graduate; experimental teach

2014-06-09

吉林大学教学改革项目(2013326)

张 英(1979-)，女，吉林九台人，硕士，实验师，主要从事细胞生物学与分子生物学研究，流式细胞仪的操作与管理。

Tel.：13504429639； E-mail:zhangying636@126.com

黎宏宇(1983-),男，吉林长春人，硕士，实验师，从事人力资源管理。Tel.:13843090842;E-mail:lihongyu@jlu.edu.cn

Q 291

A

1006-7167(2015)05-0182-04