基于EDS的鱼类耳石微化学分析实验条件选择

郭弘艺， 张旭光， 邵 露， 殷曦敏

(上海海洋大学 农业部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306)



基于EDS的鱼类耳石微化学分析实验条件选择

郭弘艺， 张旭光， 邵 露， 殷曦敏

(上海海洋大学 农业部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306)

研究能谱仪在鱼类耳石微化学分析中的应用，探索一套适用于鱼类耳石标准样品定量分析实验条件。结果表明，样品表面粗糙会对特征X射线产生几何效应，使得分析强度降低，造成实验结果误差。耳石样本最适用烘干干燥法，其操作过程为：耳石放入干净培养皿后，在恒温烤箱60 °C烘干6～8 h。样品干燥后，表面喷金待用。为获得精确的分析结果，实验参数应根据样品大小，实验目的所需要关注的组成元素和仪器性能来选择。加速电压Uo一般为临界激发电压Uk的2～10倍。最适工作距离为20 mm，单点扫描活时间为200 s以上，死时间10%～15%。聚焦参数应该根据耳石样品不同的大小选择，尽可能兼顾缩短测量时间和保证足够的空间分辨率。

耳石； 扫描电镜； 能谱仪； 鱼类

0 引 言

鱼类耳石具有代谢惰性，在生长发育过程中，水环境中的化学元素一旦被耳石沉积，就很难再被机体吸收，成为记录鱼类生活史的元素指纹。因此，耳石微化学分析已成为解决鱼类生活史及环境史重新构建、出生地溯源、混合群体识别、种群鉴定、海洋环境反演等问题的关键技术[1-5]。

X射线能量色散谱分析(Energy Dispersive X-Ray Spectroscopy, EDS)，简称X-射线能谱分析，是20世纪70年代迅速发展起来的一种元素测试技术，可配置在扫描电子显微镜或透射电子显微镜上，能对样品做无损伤分析，具有操定性、定位和定量分析一次完成的优点[6-14]。目前，国内众多科研院校均配置了扫描电子显微镜与能谱仪，但对鱼类微化学领域研究较少，特别缺乏鱼类耳石微化学研究的能谱分析实验手段和技术研究。本文利用我校现有的日立S-3400N型扫描电镜配置布鲁克 QUANTAX 400-10 型能谱仪，基于EDS的鱼类耳石微化学分析实验条件的进行探索和研究，以期为从事该领域研究的人员提供帮助。

1 实验方法

1.1 主要仪器

SEM 试验仪器为日立S-3400N型扫描电镜；EDS试验仪器为布鲁克 QUANTAX 400-10 型能谱仪(ESPRIT 1. 9 软件系统)；探测器为SSD硅漂移探测器。

1.2 试验样品

分析样品为刀鲚成鱼和日本鳗鲡幼鱼的矢耳石(见图1)。

图1 刀鲚成鱼和日本鳗鲡幼鱼耳石

1.3 分析流程

分析流程如图2所示，重复多次测试，筛选最适合实验条件。

2 结果和分析

2.1 耳石样品制备和实验前预处理

2.1.1 耳石制备

已有研究表明，样品表面粗糙会对特征X射线产生“几何效应”：一方面是所产生的一部分X射线射出后被边缘突起部分吸收；另一方面在不同角度的表面上所产生的X射线，有相当一部分背离探测器的方向。由于这两部分X射线的损失，使得分析强度降低，造成实验结果误差[15]。本实验结果表明，表面未经抛光的耳石样品分析误差明显大于均匀打磨至100 μm薄片的耳石误差，均一厚薄光滑表面的耳石样品较未经处理的不均一粗糙表面样品，钙和锶元素分析误差分别由4%和8.9%降至1%和5.8%(见表1)。由此可见，耳石样品需打磨成为厚薄均一的耳石薄片。

图2 EDS分析流程示意图 表1 EDS法分析耳石表面元素含量及其相对误差

元素未打磨抛光的样品打磨至100μm均匀薄片样品钙Ca锶Sr含量×10-6251236.7±9931.4236813.2±2402.3误差/%4.01.0含量×10-63225.6±285.82703.8±155.8误差/%8.95.8

2.1.2 干燥法的选择

扫描电镜生物样品制备常用干燥方法包括自然干燥法、烘干干燥法、冷冻干燥法、临界点干燥法和真空干燥法。5种方法均可用于耳石的干燥，比较而言，冷冻干燥法、临界点干燥法和真空干燥法或需要专门设备和试剂，或操作复杂，而自然干燥法受温度和湿度影响且耗时长。因此，耳石样本最适用烘干干燥法，此法干燥速度较快，操作简单，所需设备容易获得。其操作过程为：耳石放入干净培养皿后，在恒温烤箱60 °C烘干6～8 h。需要注意的是，恒温烤箱温度设置过高，易导致耳石碎裂，而烘烤温度设置太低，干燥所需时间长。

2.1.3 表面喷镀材料选择

耳石样品不导电，测试前需经过喷金(Au)或喷碳(C)处理。由于耳石的主要元素为Ca、C、O，以碳酸钙(CaCO3)的形式存在，喷碳可能造成C含量叠加，因此，选择喷Au更为合适。同时，在分析时，控制窗口Element list中选中Au元素，将其设定为Deconvolution元素，即普线图上仍显示Au元素谱峰，但不纳入后续定量计算。

2.2 实验条件的选择

2.2.1 加速电压的选择

使用EDS分析耳石元素含量时，首先，应选择合适的加速电压Uo，并检查过压比。过压比为“加速电压Uo与某一分析元素给定谱线的临界激发电压Uk的比值”。当过压比低于50%，被激发元素的相互作用体积很小，不足以应用于X射线分析；当过压比大于10倍时，低能量的X射线会逃逸，造成很大误差。例如，当实验过程中关注Ca和Sr元素的含量，激发Ca和Sr的Kα能量分别为3.7和14.1 keV，同时，兼顾两者的分析效果，实验选取30 kV加速电压。

2.2.2 探测器工作距离

当探测器调到最佳工作位置时，才可获取最佳分析效果，得到最高探测能效。本研究中，日立S-3400N型扫描电镜附带布鲁克 Quantax 400-10 型能谱仪的工作距离是20 mm。

2.2.3 采集时间

耳石定量分析所需单点扫描活时间为200 s以上，死时间*死时间,是指射入检测器的没被采用的X射线信号10%～15%，效果较好。面扫描和线扫描在不精确定量，仅分析耳石内元素空间变化的情况下，可根据样品情况和分析要求，降低单点扫描活时间。

2.2.4 聚焦参数选择

束斑大小选择要同时兼顾尽可能短的测量时间和足够的空间分辨率。当样品为成鱼耳石时，如刀鲚成鱼耳石，耳石半径约2 000 μm，生长率为50 μm/周。因此，束斑可选择25 μm左右，即得到足够的空间分辨率反映生活史中元素变化；当样本为仔幼鱼耳石时，如日本鳗鲡幼鱼耳石，耳石半径为150 μm，生长率为0.5～2 μm/日。此时，束斑应选择2～5 μm，以探得生活史中元素变化。

2.3 标准物质的选择

按照《电子探针和扫描电镜X射线能谱定量分析通则》，应选择与分析样品基质性质接近，厚度相同的标准物质，同时，分析样品和标样应在相同分析条件下采集谱图，从而保证分析的精确度。据此，我们选用加拿大国家研究委员会提供的新型鱼类耳石标准物质(FEBS-1)。该标样由4.5 kg干燥的西大西洋笛鲷矢耳石制备而成，适用于定量钡、钙、锂、镁、锰、钠和锶7种元素。其基质成分与分析样品比较接近，同时，FEBS-1为粉末状，可灵活制备成不同厚度，以适用于不同大小鱼类耳石的定量分析。

3 结 语

在EDS分析前，应将鱼类耳石打磨成为厚薄均一的耳石薄片，恒温烤箱60 °C干燥6～8 h后，表面喷金待用。EDS分析实验条件应根据样品大小，实验参数应根据样品大小，实验目的所需要关注的组成元素和仪器性能来选择。Uo一般为临界激发电压Uk的2～10倍。本研究中的日立S-3400N型扫描电镜附带布鲁克Quantax 400-10型能谱仪的最适工作距离为20 mm，单点扫描活时间为200 s以上，死时间10%～15%。聚焦参数应该根据耳石样品不同的大小选择，尽可能兼顾缩短测量时间和保证足够的空间分辨率。研究结果表明，标准物质FEBS-1是基质成分与耳石接近，厚薄大小可灵活制备，满足鱼类耳石微化学定量分析。

[1] Esser B K, Volpe A M. At-sea high-resolution chemical mapping: extreme barium depletion in North Pacific surface water[J]. Marine chemistry, 2002, 79(2): 67-79.

[2] Olsson P E, Kling P, Hogstrand C. Metal metabolism in aquatic environments[M]. London: Chapman and Hall, 1998: 321-350.

[3] Yabutani T, Mouri F, Itoh A,etal. Multielement monitoring for dissolved and acid-soluble concentrations of trace metals in surface seawater along the ferry track between Osaka and Okinawa as investigated by ICP-MS[J]. Analytical sciences, 2001, 17(3): 399-406.

[4] 张 亚, 郭弘艺, 唐文乔, 等. 长江口日本鳗鲡幼体矢耳石元素的SRXRF分析[J]. 上海海洋大学学报, 2013, 22(6):821-826.

[5] Guo H Y, Zheng Y, Tang W Q,etal. Behavioral migration diversity of the Yangtze River Japanese Eel, Anguilla japonica, based on otolith Sr/Ca ratios[J]. Zoological Research, 2011, 32(4):442-450.

[6] 孟 克. 植物样品的EDX微区定量分析研究[D]. 北京：北京林业大学, 2009.

[7] 杨勇骥. 实用生物医学电子显微镜技术[M]. 上海：第二军医大学出版社, 2003:188-197.

[8] 龚 力, 陈 建, 谢方艳, 等. 光电子能谱仪新增功能研发[J]. 实验室研究与探索, 2011(11): 231-233.

[9] 杨健茂, 刘晓云, 路 平, 等. 不均匀易损伤静电纺丝样品扫描电镜表征[J]. 实验室研究与探索, 2013(10): 253-255.

[10] 王奕文, 刘 欢, 倪 兵. 生物电镜观测网上预约追踪系统的开发[J]. 实验室研究与探索, 2014(1): 133-13.

[11] 时巧翠, 严恺伦, 林顺雷, 等. 扫描电镜/能谱仪在刑事技术中的应用[J]. 实验室研究与探索, 2010(10): 32-35.

[12] 吴勤祖. 电镜维修技术探讨[J]. 实验室研究与探索, 1992(3): 30-34.

[13] 李 慧, 张静武. 拍摄高质量透射电镜照片的经验[J]. 实验室研究与探索, 2002(1): 49-60.

[14] 权茂华, 孙建林, 熊小涛, 等. 电镜实验教学中“三层次”培训体系的建立[J]. 实验室研究与探索, 2014(5): 171-174.

[15] 张淑芳, 龚克俭, 李 学, 等. 加速电压和样品表明粗糙度对EDS分析精度的影响[J]. 电子显微学报, 1993(4):352-355.

Experiment Condition Selection and Research of Fish Otolith Microchemistry Analysis Based on EDS

GUOHong-yi,ZHANGXu-guang,SHAOLu,YINXi-ming

(Key Laboratory of Freshwater Fishery Germplasm Resources, Ministry of Agriculture,Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

This paper studies the application of spectrometer in fish otolith microchemistry analysis, and explores a set of experiment conditions for quantitative analysis of fish otolith standard samples. For electron microprobe analysis the otoliths were ground into uniform thickness chips, then dried at 60°C constant-temperature oven for 6-8 hours, and finally gold coated in a high-vacuum evaporator. In order to ensure the accuracy of experimental results, experiment parameters should be determined in accordance with otolith size, experimental objective for key composition of fish otolith and instrument performance. Accelerating voltage must be higher than X-ray critical excitation voltage of all element properties measured, which is more than 2 times and less than 10 times of critical excitation voltageUkin general cases. The optimal working distance is 20 mm, with live time of over 200 s and deadtime between 10%-15% in single scan. Focusing parameters should be determined on line with otolith sample size, with full considerations to a short measurement time and sufficient spatial resolution.

otolith; scanning electron microscopy; energy spectrometer; fish

2014-07-07

上海高校实验技术队伍建设计划(B1-5407-13-0000-1)

郭弘艺(1980-)，女，江苏扬州人，工程师，现主要从事鱼类生物学研究。Tel.:021-61900445；E-mail:hy-guo@shou.edu.cn

Q 336

A

1006-7167(2015)05-0024-03