全自动细胞分选仪对单细胞筛选的优化与应用

张 芳, 李丽莉, 杨怡姝, 李劲涛, 盛 望, 李泽琳, 曾 毅

(北京工业大学 生命科学与生物工程学院，北京 100124)



全自动细胞分选仪对单细胞筛选的优化与应用

张 芳, 李丽莉, 杨怡姝, 李劲涛, 盛 望, 李泽琳, 曾 毅

(北京工业大学 生命科学与生物工程学院，北京 100124)

以Ec-109、BHK细胞为例，采用AVISO细胞分选仪进行单细胞的分选与优化。首先，将电脑中的细胞筛选软件与显微镜相连接，依据不同的细胞类型，设置合适的挑选参数，并从X、Y与Z轴层面精确校准挑选位置。通过自由设定细胞特征参数，可准确地挑选到目标细胞。最后，检测分析细胞筛选率，均可达到90%以上。该筛选技术对单细胞的挑选可提高到可视化水平，与常规筛选方法相比，样品不需特殊处理，细胞收集方便，节约操作时间，提高了实验效率。

全自动细胞分选仪； 细胞筛选； 特征参数

0 引 言

随着现代生物学的发展，单细胞的研究逐渐受到关注。单细胞分析可以获得反映细胞生理状态和过程更准确、更全面的信息，对于研究细胞的信号转导、生理病理和重大疾病的早期诊断十分重要[1-3]。然而，单细胞提取数量少，分析困难大，常用的筛选方法有流式细胞术(FCM)、高通量定向细胞筛选技术等[4-6]，但FCM筛选细胞需要数量多，筛选后仅获得细胞群，而不是单一的细胞；常规的定向筛选是在96孔或384孔板中加抗生素，通过不断的加压筛选出有活性的细胞，该操作简单，但工作量大、耗时长、容易产生假阳性[7-8]。因此，提高单细胞阳性筛选率势在必行。

AVISO细胞分选仪是最新一代全自动单细胞分选、细胞群分离的自动化系统，能完整记录细胞扫描及克隆挑选全过程，通过自由设定细胞特征参数(如形态学、荧光信号等)进行高通量单细胞筛选与分析。使用范围广，对贴壁细胞、悬浮细胞、干细胞以及组织等多种样品均可使用。阳性细胞获取率高，样本细胞不需要处理，方便快速，特别适用于低细胞数量的筛选。将细胞培养、收集提高到一种高分辨可视、选择性控制的全新水平，在细胞生物学、再生医药研发研究领域处于领先优势[9-11]。本文对AVISO细胞分选仪功能与应用进行了探究，描述了系统分选细胞的整个过程，并以转染绿色荧光蛋白(EmGFP)的食管癌Ec-109细胞与感染痘苗病毒的BHK细胞为研究对象，观察不同种细胞分选后单细胞阳性获取率及细胞存活率。

1 实验材料与仪器

(1) 材料。Ec-109细胞(稳定转染pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR203 vector)、BHK细胞(转染EmGFP，感染痘苗病毒)，75%乙醇(国药集团，北京)，PBS、1640培养基、DMEM购自Gibico公司，6孔板与96孔板分别购于NEST公司，EXPRESS SYBR®GreenERTMmiRNA qRT-PCR 检测试剂盒(Invitrogen，USA)。

(2) 仪器。AVISO细胞分选仪 (德国Greiz-Gommla公司)。

2 实验方法与结果

2.1 细胞挑选程序的设置

首先从CellCelector细胞挑选模块中选取直径为

50 μm的玻璃毛细管作为挑选工具，将待选细胞板、目标板、PBS、75%乙醇分别放在固定位置(见图1)。双击打开Cellcelector software软件，将仪器与电脑软件相连，弹出运行程序对话框，选择“Init Device”进行初始化设备。检测毛细管和管道是否存在气泡，如果有大的气泡，点击“Program”中的“System liquid manager”按程序手动点击“Next”通直到气泡被排除。点击“Configure decktray”、“Heating”、“Cell types”设置目标板及收集细胞孔的位置、加热器的温度(37 ℃)、细胞类型等相关参数(见图2)。点击“Sterilize”，机械臂自动将挑选细胞的玻璃毛细管置于75%乙醇中消毒5 s，可反复操作多次。

1-倒置显微镜，2-自动化载物台，3-CCDS显微镜，4-自动机械臂，5-一次性枪头，6-目标板图1 AVISO全自动细胞分选仪

2.2 细胞挑选位置的校准

挑选位置的校准对于单细胞或细胞克隆团的精确挑选至关重要。首先进入“Program”，点击“Calibrate Pickup Position”，从X轴、Y轴与Z轴三层面进行准确缓慢校准，调整合适的参数直至毛细管与电脑界面设置的中心位置相对称(见图3)，绿色的“Plate base not touched”转变为红色的“Plate base touched”即表示毛细管已接触到细胞板底面，再继续点击Z轴的“↑”，“Next”，“End”键直至机械臂自动归位。

图2 AVISO细胞分选仪相关参数设置界面

2.3 细胞挑选

细胞类型不同，挑选参数的设置也不同。最佳参数的优化对于细胞的成功挑选至关重要。Ec-109细胞为食管癌细胞，具有较强的贴壁能力，在挑选参数设置时可增加吸取速度值到45，但挑选为单个细胞，因此吸液量设置较低为0.1 μm，每次吸入细胞数设置为

图3 AVISO细胞分选仪挑选位置校准参数界面及其校准图

1个(见图4)。而BHK细胞尽管为贴壁细胞，但感染痘苗病毒后，贴附能力降低，因此在挑选参数设置时降低吸取值优化至25，由于吸取细胞团感染病毒且成簇，因此将吸液量设置为0.3 μm。

图4 细胞类型与挑选参数设置表

在仪器的使用过程中，用户可以自由设定细胞特征参数(如形态学、荧光信号等)。相机根据参数要求自动扫描培养皿的设定区域，检测到目的细胞并将位置数据自动传到软件。实验中，因筛选细胞均转染EmGFP基因，以绿色荧光信号为特征参数。开启荧光灯界面，选择2通道，即GFP绿色通道，选择所需要细胞克隆，点击“Pick selected particle”， 并能连续选取细胞在“Add Particle from live image” (见图5、6)。

图5 细胞挑选设置参数

图6 细胞挑选添加菜单

2.4 实验结果

Ec-109细胞转染了既表达miR-203又能表达EmGFP的质粒。挑选中，以绿色荧光蛋白为特征参数，选取荧光强度高的单个细胞，以15个单细胞为一组，机械臂自动将挑选好的细胞按设定位置放入96孔板中。之后置37 °C孵箱中培养。待细胞铺满瓶壁时观察荧光感染率达到90%以上，细胞活性高，提取RNA，检测miR-203的表达，表达溶解曲线图如图7所示。

图7 Ec-109细胞挑选与miR-203的检测结果

感染痘苗病毒的BHK细胞经过第1次挑选后低温破碎细胞，释放病毒液并感染正常细胞，培养24 h后病毒感染率在60%左右。将感染后的发绿色荧光细胞团二次挑选，再一次感染正常BHK细胞，细胞的感染率达到95%以上(见图8)。

图8 BHK细胞挑选与感染结果

3 结 语

AVISO全自动细胞分析分选系统CellCelector将细胞筛选提高到可视化的水平，与常规筛选方法相比，节约了操作时间，显著提高了实验效率。该系统除可全自动细胞分选外，还能进行细胞样品处理与分析，是高通量细胞生物学分析最有效的研究平台[12,13]。操作样本不需要特殊处理，待分离的细胞可直接被吸入到50nl-12 μl液体培养基、基底膜或甲基纤维素半固体培养基中，细胞克隆或组织片段也可以被金属刮取毛细管通过刮取移动模式从细胞群中成功分离，这对于玻璃载玻片上的组织切片和液体培养基中的克隆细胞尤为重要[14-15]。

此外，该系统收集细胞方便，收获的细胞或组织材料可以被自动转移到任何种类的培养器皿，像细胞培养皿、细胞培养板、玻璃载玻片等。高精度细胞定位使单细胞微孔板铺板，单细胞、或单细胞PCR制备变为可能，为细胞生物学的深入研究提供了有力的手段。

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Optimization and Application of Single Cell Screening by Automated Cell Selector

ZHANGFang,LILi-li,YANGYi-shu,LIJin-tao,SHENGWang,LIZe-lin,ZENGYi

(Department of Life Science and Bioengineering， Beijing University of Technology， Beijing 100124， China)

A novel, facilitate and rapid high-throughput technology for cell directional selection was introduced. The operation processes of single cell selection and optimization were detailly described by using Ec-109 cells and BHK cells as examples. Firstly, the screening software in the computer was connected with microscope. The appropriate parameters of screening were setting according to the cell type, and the location of screening was calibrated from theXaxis,Yaxis andZaxis. The target cells were selected accurately through freely setting cell feature parameters. Finally, cell screening rates were detected and analyzed, and the results could reach above 90%. The new automated screening technology of single cell can be achieved to the visual level compared with the conventional screening method. The sample doses not need special treatment, and cells are collected conveniently. The new method saves the operating time, and improves the experiment efficiency significantly.

automated cell selector; cell screening; characteristic parameter

2014-07-29

国家科技重大专项(2014ZX10005002)；北京市教委科技面上项目(KM201510005027)；北京工业大学研究生课程建设项目(CR2013-B-015)

张 芳(1976-),女,山西晋中人,博士,助理研究员,主要从事于纳米药物分子抗肿瘤的研究。

Tel.:010-67392780;E-mail:zhangfang2000@bjut.edu.cn

G 633.91

A

1006-7167(2015)05-0021-03