果汁中维生素C荧光法测定的实验设计与教学探索

黄方志， 沈玉华， 李士阔， 谢安建

(安徽大学 化学化工学院， 安徽 合肥 230039)



果汁中维生素C荧光法测定的实验设计与教学探索

黄方志， 沈玉华， 李士阔， 谢安建

(安徽大学 化学化工学院， 安徽 合肥 230039)

通过果汁中维生素C的荧光法测定实验，学生不仅能掌握正交设计法以及样品前处理方法，还能更好地理解和掌握荧光的分析原理、操作方法、定性、定量方法及其在化合物检测分析研究中的重要性。经过几年的教学实践、探索与完善，教学成效已初步显现。

荧光分光光度法； 化学综合实验； 实验教学； 创造性思维

0 引 言

维生素C在人体内不能合成, 只能从食物和药物中摄取，因此, 食品、药物中维生素C的分析与测定具有重要意义[1-9]。在Deutsch和Weeks报道的维生素C 的经典荧光分析检测法(OPDA)的基础上，结合正交实验设计，构建了一例简便易行、结果明显、样品处理简单、快速,体系稳定性好，并能与分析化学理论知识紧密结合的化学综合实验。本实验以日常生活中常见的饮品为原料，贴近生活，激发了学生的实验激情与主动性。将经典的荧光分析法与正交设计结合起来，使学生在掌握荧光分析法基础知识和基本技能的同时，培养他们的创新思维。

化学综合实验是针对分析化学专业高年级本科生开设的，在本科毕业论文开始之前，设计6个化学综合实验，通过几个典型的综合实验教学，使学生系统地掌握分析化学专业综合知识，达到对知识的融会贯通。共安排48学时，一个班分成6个大组，每大组分成4个小组，每小组2或1人，其中荧光分析仪器有2台，实验采用循环模式。整个实验教学过程包括，引导学生如何完善具体的实验方案以及实现对样品的前处理；借助正交设计实验在有限的时间内完成样品测试最佳实验条件的确定；各种试剂的配制；试样的处理与测试机理以及影响测试结果的因素、定性定量方法等。

1 实验内容

1.1 实验目的

了解样品前处理的方法，掌握分子荧光分析法的基本原理及其仪器组成，掌握正交设计的基本方法及应用，熟悉荧光法测定食品中维生素C含量的方法。

1.2 实验原理

荧光是物质吸收光的能量后产生的，因此任何荧光物质都具有两种光谱：激发光谱和发射光谱。

维生素C本身无明显的荧光效应，因此，需要预先处理。维生素C先被活性炭(Norit)氧化为脱氢抗坏血酸(DHAA)，DHAA再与荧光底物邻苯二胺(OPDA)结合生成荧光产物，通过对该荧光产物的检测实现对维生素C的定量分析[10]。进一步，采用十六烷基三甲基溴化铵产生荧光协同增敏作用[11]。

1.3 仪器与试剂

F-2500荧光分光光度计；FA2004A电子分析天平。 PHS-3CT精密酸度计；乙酸钠溶液(5 g/L，25 g/L，100 g/L)；活性碳；邻苯二胺溶液(2 g/L)；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)溶液(6.0×10-4g/mL)；偏磷酸-冰醋酸-硫酸溶液：称取15g偏磷酸，加入40 mL冰醋酸，用0.015 mol/L 硫酸稀释至500 mL；硼酸-乙酸钠溶液：称取硼酸9 g，加入35 mL乙酸钠溶液，用水稀释至1 000 mL(使用前配制)；抗坏血酸标准溶液：准确称取0.500 g抗坏血酸溶于偏磷酸-冰醋酸溶液中，定容至500 mL容量瓶中，此标准溶液浓度为每毫升相当于1 mg的抗坏血酸(新鲜配制)；吸取上述溶液5 mL，再用偏磷酸-冰醋酸溶液定容至50 mL，此溶液每毫升相当于0.1 mg的抗坏血酸标准溶液(新鲜配制)；维生素C样品：果珍或橙汁；实验所用试剂均为分析纯；实验用水均为二次蒸馏水。

1.4 实验步骤

1.4.1 维生素C标准溶液的测试

将制备好的50 mL标准溶液(含抗坏血酸0.1 mg/mL)倒入烧杯中，加1～2 g活性炭摇匀1 min，过滤。取50 mL容量瓶1只，准确移取刚处理过的溶液1.0 mL，再加入20 mL硼酸-乙酸钠溶液，用水定容至刻度，得到0.002 mg/mL 抗坏血酸/乙酸钠溶液，此液作为标准空白溶液，测定荧光强度作为试剂空白(F0)。再取10 mL带刻度的试管，吸取0.5 mL 上述溶液，用蒸馏水定容至3.0 mL；在避光的环境中，迅速向各管中加入5 mL邻苯二胺溶液，2.0 mL 十六烷基三甲基溴化铵溶液, 加塞，振摇1～2 min，在室温下，于暗处放置35 min，测量荧光强度F(激发波长350 nm，发射波长433 nm)。最终的荧光强度为计算ΔF=F-F0。

1.4.2 样品的测试

(1) 测试条件的确定。 实验中选用乙酸钠溶液为pH缓冲体系与氧化剂、CTAB为增敏剂、邻苯二胺为辅助剂进行实验，并采用模拟科研最佳条件的确定—正交实验的方法确定各种物质的最佳用量：以乙酸钠溶液的浓度(A)、CTAB用量(B)、邻苯二胺用量(C)以及反应温度为考察因素(见表1)，以产物的荧光强度为考察指标，即采用4 个因素3 个水平的正交实验表L9(34)(见表2)进行实验。实验前及实验过程中对问题进行讨论，实验后将结果汇总，进行正交分析，以确定各种物质的最佳用量[12-15]。

表1 正交实验因素水平

[注]:A为乙酸钠溶液的浓度(g/L), B CTAB用量(mL), C为邻苯二胺用量(mL), D为反应温度(℃)

表2 正交实验的结果与分析

Ki(i= 1,2,3) 为：水平i三次考察指标(产物荧光强度) 之和的平均值；S为极差：由同一影响因素的K/3(K1/3、K2/3 、K3/3)中的最大值减去最小值。由极差分析可知， A 、B、C、D 四因素对产率影响顺序，若为C > D > B > A，则表明邻苯二胺用量的改变对产物的荧光的影响作用最大。同时，依据表中数据，产物的荧光强度最强的条件，即为四种物质的最佳用量。

(2) 工作曲线、线性范围、检出限。分别移取0.5、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0、2.5、3.0 mL 按1)维生素C标准溶液的测试方法中得到的0.002 mg/mL 抗坏血酸/乙酸钠溶液，置于10 mL 带刻度的试管中，并稀释至3.0 mL得到系列维生素C标准工作溶液，在最佳实验条件下，按实验方法进行测定，以荧光强度F对维生素C的浓度c(μg/mL)进行线性回归，确定维生素C在什么浓度范围内(例如浓度在0. 02～8.0 μg/mL范围内)，与荧光强度呈良好的线性关系，采用Origin软件求出其线性回归方程以及相关系数。条件容许还可继续测定其检出限，以确定其灵敏度。

(3) 精密度试验。对5.0×10-4g/mL的维生素C标准工作溶液测定7次，求出其相对标准偏差，确定其精密度。

(4) 样品测定。称取均匀样品10 g，用偏磷酸-冰醋酸溶液定容至100 mL，定容后过滤；将全部滤液转入烧杯中加入1～2 g活性炭振摇1～2 min，过滤。取2只50 mL容量瓶，各加入5.0 mL经氧化处理的样液，并依据正交设计的实验结果添加一定量的CTAB溶液，再向其中一只加入20 mL 乙酸钠溶液，用水稀释至50 mL作为样品溶液；另一只加入20 mL硼酸-乙酸钠溶液，用水稀释至刻度，作为样品空白溶液。再取2支带塞的刻度试管，1支试管中加2.0 mL样品溶液为样液，另一根试管中加入2.0 mL样品空白溶液作为空白，再分别用蒸馏水定容至3.0 mL。在室温下，在避光的环境中，迅速向各管中加入5 mL邻苯二胺溶液，加塞，振摇1～2 min，于暗处放置35 min。最佳发射波长条件下，测量荧光强度F，同时测定样品空白溶液荧光强度F0，并计算得出实际荧光强度ΔF=F-F0。

最后，依据维生素C的标准曲线，确定果珍中维生素C含量。

1.5 分析过程中的注意点

(1) 标准抗坏血酸溶液必须现用现配。

(2) 活性炭处理样品前，一定要先进行活化处理。

(3) 荧光测试过程中，多次测定，取平均值。

(4) 在处理各种样品时, 如遇到泡沫产生, 可以加入数滴辛醇消除。

1.6 实验教学效果评价

在教学实验过程中，我们以新世纪创新型人才的培养为目标，依据《普通高等学校本科教学工作水平评估方案》的导向要求，在传统的评价体系的基础上，引入多元智能理论，奉行多元化、情境化、发展性以及量化评价和质性评价相结合原则，采用口试、过程检测与档案袋评价相结合的方式对学生的各种实验技能、实验思维等作比较全面的评价。在近两年的实验教学过程中，实验效果评价的结果是20%左右优秀，15% 的操作不理想，其余为中等水平; 学生普遍反映该实验设计有助于理解荧光法的实验原理，定性定量方法，以及正交实验的系统设计与分析条件的优化。

2 结 语

实验时，每人测定1 份果珍样品，使每位学生独立地完成样品前处理、定性、定量分析所要求的分析测试操作，且每份果珍样品的质量各不相同，防止有人“跟帮坐车”或抄袭实验数据。对实验成绩的考核，重点放在对实验的设计、实验现象的解释、对老师所提问题和思考题的回答以及动手操作上; 这些基本上能反应学生分析问题、解决问题和动手能力的强弱。通过该实验既有利于启迪学生的创新、设计思维，又有利于培养学生实践、实际操作、创造、创业的能力以及强烈的责任心。

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Experimental Design and Teaching of Determination of Vitamin C by Fluorescence Spectrophotometry

HUANGFang-zhi，SHENYu-hua,LIShi-kuo,XIEAn-jian

(School of Chemistry & Chemical Engineering, Anhui University， Hefei 230039， China)

A high-quality experimental chemistry course (Determination of vitamin C by fluorescence spectrophotometry) was designed and renewed through the reform practice of experimental teaching. In the experimental teaching, it was proved to be of value in training students' comprehensive and practical ability and in enlightening students' creative thoughts in their research activities. During the experiment process, students not only learn the method of orthogonal design and sample preparation, but also better understand and master the analysis principles, operation methods, qualitative and quantitative methods, and importance of fluorescence spectrophotometry in the analysis of natural compounds. A couple of years' running demonstrates that the high-quality experimental chemistry course is effective.

fluorescence spectrophotometry; chemical comprehensive experiment; experimental teaching; creative thinking

2014-09-15

国家自然科学基金(50973001);安徽大学教育教学改革研究项目(JYXM201331)；安徽大学精品实验项目(SY201202)

黄方志(1978-)，男，安徽怀宁人，副教授，硕士生导师，基础化学实验中心副主任，研究方向:功能材料的制备与应用研究。

Tel.:0551-63861327; E-mail:huangfangzhi@163.com

G 642.423

A

1006-7167(2015)05-0097-03