丙戊酸钠减轻博莱霉素致大鼠肺纤维化*

高淑艳， 冯 涛

(胜利油田中心医院呼吸内科，山东 东营 257034)



丙戊酸钠减轻博莱霉素致大鼠肺纤维化*

高淑艳， 冯 涛△

(胜利油田中心医院呼吸内科，山东 东营 257034)

目的： 探讨丙戊酸钠在博莱霉素诱导的肺纤维化中的作用及机制。方法: 42只大鼠随机分为正常对照组、模型组和治疗组。造模采用博来霉素5 mg/kg气管内注射，自造模14 d开始分别采用生理盐水(0.5 mL/d)、丙戊酸钠(300 mg·kg-1·d-1)和地塞米松(0.6 mg·kg-1·d-1)腹腔内注射治疗14 d。模型组分别在造模后14 和、28 d处死。治疗组在造模后28 d处死。然后通过HE染色、Masson染色、羟脯氨酸(HYP)检测和Western blotting检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)及E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达的变化，综合分析丙戊酸钠对肺纤维化发展的干预作用。结果: HE染色显示丙戊酸钠治疗组的肺泡结构、肺间质的形态优于生理盐水组和地塞米松治疗组。Masson染色及HYP检测用于衡量肺组织内胶原的分布及含量，可见丙戊酸钠治疗组肺组织内胶原的分布及含量均显著低于地塞米松治疗组及生理盐水组。丙戊酸钠可以降低α-SMA的表达，同时上调上皮标志性蛋白E-cadherin的表达。结论: 丙戊酸钠可以通过减少胶原的表达与分布及下调间充质蛋白α-SMA，同时上调上皮蛋白E-cadherin的表达从而减轻博来霉素诱导大鼠肺纤维化。

肺纤维化； 博来霉素； 丙戊酸钠； α-平滑肌肌动蛋白； E-钙黏蛋白

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种病因不明的慢性进展性破坏性肺疾病，以肺泡上皮细胞损伤、成纤维细胞增殖、肌成纤维细胞灶形成和细胞外基质的过度沉积为特征[1]。特发性肺纤维化是间质性肺炎中最常见的一种，多见于中老年人，临床多表现为刺激性咳嗽、进行性的呼吸困难，是一种慢性、进行性、致命性的间质性肺疾病，中位生存期为诊断后的2～3年，最终死于呼吸/循环衰竭。临床上至今尚无有效的药物可以逆转或延缓该病的进展[2]。因此，通过研究肺纤维化发病及治疗的相关分子机制对于进一步指导临床用药具有重要的意义。

近年来研究表明，上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)现象在肺纤维化发病中发挥着重要作用，其中E-cadherin和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)是EMT现象中的主要靶基因。E-cadherin的缺失会降低细胞之间的黏附性，同时增加细胞迁移性，促进EMT的发生；E-cadherin的过表达有助于逆转EMT，即促进肺间质细胞转化为肺泡上皮细胞[3]。α-SMA是最为常用的肌成纤维细胞的分子标志，在肺纤维化发生中肌成纤维细胞增殖表达α-SMA形成纤维细胞灶，最终引起肺泡结构破坏甚至肺硬化[4]。研究表明，吉非替尼可能通过抑制EGFR/Akt通路，增强转录因子Foxo3a活性，抑制上皮-间质转分化，从而减轻博来霉素诱导的肺纤维化[5]。

丙戊酸钠(sodium valproate，VPA)是一种组蛋白脱乙酰基转移酶抑制剂，可以降低肝星形细胞内TGF-β的生成，减少TGF-β诱导的胶原合成，在纤维化性疾病的治疗上具有潜在价值[6]。研究显示，VPA可能通过下调组蛋白去乙酰化酶2、8改善肾性高血压大鼠肾脏纤维化[7]。而基于肺纤维化是长期慢性隐匿性炎症的最终结局的理论，糖皮质激素以及其它免疫抑制剂(咪硫唑嘌呤等)是最先用于治疗肺纤维化的主要药物。糖皮质激素作用于免疫系统的体液和细胞免疫，降低促炎分子的水平，从而对抗炎症诱发的肺纤维化[8]。本研究通过大鼠气管内注射博莱霉素构建肺纤维化的动物模型，从而探索丙戊酸钠对肺纤维化的治疗机制。

材 料 和 方 法

1 实验动物与试剂

健康清洁级雄性SD大鼠42只，体重180～220 g，购自烟台绿叶制药有限公司实验动物中心；博莱霉素购自胜利油田中心医院；丙戊酸钠购自Sigma；Masson染色试剂盒及羟脯氨酸(hydroxyproline，HYP)检测试剂盒均购自南京建成科技有限公司；α-SMA抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；E-cadherin抗体购自Santa Cruz。

2 实验方法

2.1 动物分组及造模 SD大鼠(180～220 g)随机分为正常对照组、模型组(14 d、28 d)、生理盐水(normal saline，NS)组、VPA组和地塞米松(dexamethasone，DEX)组。饲养环境为洁净级动物房，适应性喂养7 d，实验期间大鼠自由饮水和进食。造模前用4%水合氯醛(0.1 mL/kg)麻醉大鼠，将大鼠背位固定于手术台，无菌操作下做颈部正中切口，逐层暴露气管，于气管环间隙向心方向穿刺缓慢注入博来霉素5 mg/kg，注入药物后，将大鼠直立旋转2 min，使药液在双肺分布均匀，后缝合皮肤，放入鼠笼饲养。治疗组自造模14 d开始分别采用生理盐水(0.5 mL/d)、丙戊酸钠(300 mg·kg-1·d-1)和地塞米松(0.6 mg·kg-1·d-1)腹腔内注射治疗。模型组分别在造模后14 d、28 d处死取材，治疗组在造模28 d即治疗14 d后处死取材。取右肺，4%多聚甲醛固定，常规病理学方法脱水、包埋、切片，HE染色观察形态学改变，Masson染色观察胶原表达。取左肺冻存于液氮用于蛋白分析。

2.2 HYP检测及Masson染色 均严格按照南京建成科技有限公司快速Masson染色说明书及羟脯氨酸测试盒说明书进行。Masson染色胶原阳性表达为蓝色，采用Image-Pro Plus 6.0软件进行拍照随机取3个不重叠视野进行积分吸光度(integral absorbance，IA)分析，半定量分析各组胶原的相对表达量。

2.3 免疫蛋白印记检测E-cadherin及α-SMA蛋白表达 取100 mg冻存肺组织加入总蛋白提取液放入预冷研钵内研磨匀浆，后吸入EP管冰上裂解40 min，1 200 r/min离心10 min，取上清，加入1/4体积的5×SDS上样缓冲液，煮沸10 min，SDS-PAGE分离蛋白，蛋白转至PVDF膜，7%脱脂奶粉封闭后，转有蛋白的PVDF膜与 I 抗(E-cadherin 1∶200，α-SMA 1∶300)4 ℃孵育过夜，TBST清洗后与HRP标记的II抗孵育2 h，清洗后加ECL发光液显影，在化学发光检测系统中(Clinx Science Instruments)成像，并测其灰度值。以β-actin为内参照。

3 统计学处理

采用SPSS 16.0软件进行数据分析，计量数据以均数±标准差(mean±SD)表示，多组均数比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 HE染色观察VPA对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化形态学改变影响

正常对照组大鼠肺组织结构正常，无明显炎症细胞浸润及胶原纤维增生；14 d模型组肺泡间质炎症细胞浸润，肺泡塌陷，间质胶原纤维增生，肺泡间隔增厚；28 d模型组肺泡炎症明显减轻，主要是成纤维细胞大量增生，间质大量胶原纤维沉积，明显的纤维化样改变。NS组在病理形态上同模型组28 d，肺泡结构破坏，肺泡间隔明显增厚。VPA组及DEX组的肺泡形态较NS组的肺泡形态规则，间隔较NS组明显变薄，其中以VPA组更为明显，见图1。

Figure 1.Histologic changes of the rat lung tissues (HE staining, the scale bar = 150 μm). A: control group; B: 14 d model group; C: 28 d model group; D: NS- group; E: VPA group; F: DEX group.

2 Masson染色观察VPA对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化胶原分布及半定量IA分析大鼠肺组织内胶原含量的变化

0 d正常大鼠肺组织对照组，无明显的胶原纤维的沉积，肺泡结构规则、整齐；博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化14 d模型组，蓝色胶原沉积在肺泡间隔中弥漫分布，随着造模时间延长，28 d模型组肺组织大量蓝色胶原沉积于肺泡间隔及肺间质。VPA组及DEX组较NS组的蓝色胶原沉积均有不同程度减轻，其中VPA组较DEX组的蓝色胶原沉积减少更加明显。采用Image-Pro Plus 6.0对胶原蓝色阳性表达区进行IA分析，结果显示随着造模时间延长，肺组织内胶原含量明显上升，VPA及DEX治疗均可以明显降低肺组织内胶原含量，其中VPA组较NS组及DEX组的胶原水平有显著减低，各组差异均具有统计学意义，见图2。

Figure 2.The collagen contents in the rat lung tissues (Masson staining, the scale bar = 150 μm). A: control gorup; B: 14 d model group; C: 28 d model group; D: NS group; E: VPA group; F: DEX group.Mean±SD. n=7. **P<0.01 vs control; #P<0.05 vs 14 d model; △P<0.05 vs NS； ▲▲P<0.01 vs VPA.

3 大鼠肺组织HYP含量检测

大鼠肺组织中的HYP检测结果显示，随着博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化造模时间的延长，肺组织内HYP的含量逐渐上升，各组比较均有统计学意义。VPA及DEX治疗有助于降低大鼠肺组织内HYP的含量，其中VPA组效果明显优于DEX组，见图3。

Figure 3.The hydroxyproline (HYP) contents in the rat lung tissues at different time points and with different treatments. Mean±SD. n=7. **P<0.01 vs control; #P<0.05 vs 14 d model; △△P<0.01 vs NS; ▲P<0.05 vs VPA.

4 Western blotting检测大鼠肺组织内E-cadherin及α-SMA蛋白的表达

Western blotting实验结果显示，VPA组及DEX组的肺泡上皮标志性蛋白E-cadherin的表达较NS组增加，VPA组的E-cadherin增加更加明显。相反，VPA及DEX治疗均可以降低间充质肌成纤维细胞的标志性蛋白α-SMA的表达。分别对各治疗组E-cadherin、α-SMA蛋白及内参照β-actin蛋白电泳条带进行灰度分析，VPA组及DEX组较NS组可以明显降低α-SMA，同时增加E-cadherin的表达，VPA组的治疗效应较DEX组更为显著，各组差异均具有统计学意义，见图4。

Figure 4.The expression of E-cadherin and α-SMA determined by Western blotting. Mean±SD. n=7. *P<0.05, **P<0.01 vs NS; #P<0.05 vs VPA.

讨 论

IPF是一种病因不明的慢性间质性肺疾病，目前为止，仍没有有效的药物可以减轻或逆转该病的进程，因此阐明其发病机制，寻找新的治疗靶点，具有深远的社会效应及现实意义。近年研究发现，肺泡上皮细胞损伤与异常修复导致纤维化可能是IPF的重要发病机制。针对损伤和异常修复过程中相关的基因及蛋白因子进行干预是当今研究IPF发病机理及治疗的热点。TGF-β是研究最为广泛的一种促纤维化细胞因子，它的生物学效应广泛，参与细胞生长、凋亡、分化、迁移等生理过程，尤其是可以通过增加细胞外基质的沉积促进损伤修复[9]。

组蛋白脱乙酰酶决定组蛋白的乙酰化状态控制着基因的表达。前期实验表明，组蛋白脱乙酰化酶抑制剂VPA，可以通过上调上皮标志性蛋白E-cadherin同时下调间质性蛋白α-SMA，减轻肾损伤诱导的肾纤维化[10]。Kee等[11]研究表明VPA可以通过降低相关的纤维化因子的表达水平，减轻DOCA-salt诱导的高血压大鼠模型心肌肥厚及心肌纤维化。此外，Mannaerts等[12]发现VPA可以通过抑制肝星形细胞转分化而减轻CCl4诱导的小鼠肝纤维化。本研究通过丙戊酸钠腹腔内注射观察VPA对博莱霉素诱导的肺纤维化的干预作用，通过比较发现VPA及DEX治疗均可以降低博莱霉素诱导的肺纤维化，VPA治疗更有助于肺泡维持正常的结构，减少肺泡破坏。Masson染色及HYP检测发现VPA可以有效降低胶原的表达量，效果明显优于传统DEX治疗。

纤维/肌纤维细胞的激活、细胞外基质的蓄积是纤维化性疾病发生发展的共同特点。肌成纤维细胞有3种来源，肺间质固有成纤维细胞的激活增生、EMT及循环中的骨髓源性成纤维细胞[13]。EMT现象作为肌成纤维细胞重要来源之一，有效阻断或降低EMT现象的发生是纤维化疾病治疗的新靶点。E-cadherin和α-SMA作为EMT现象中的标志性蛋白，被认为是评价肺纤维化发生及严重程度的重要指标。本研究通过博莱霉素气管内注射成功建立大鼠肺纤维化模型，分别从病理形态、肺组织胶原含量检测及纤维化发生的重要蛋白指标的表达分析不同层面，研究VPA对博莱霉素诱导的肺纤维化的干预作用。实验表明，与NS及DEX干预组比较，VPA可以更显著地降低肺间质内ECM蓄积，减少HYP及胶原的产生，降低间质相关蛋白的表达，上调肺泡上皮标志性蛋白的水平，有助于减轻博莱霉素诱导的大鼠纤维化。VPA在肺纤维化的治疗中具有潜在的临床价值，有待于进一步系统性的研究。

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VPA alleviates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats

GAO Shu-yan, FENG Tao

(DepartmentofRespiratoryMedicine,ShengliOilfieldCentralHospital,Dongying257034,China.E-mail:fengtao1972@163.com)

AIM: To investigate the effect of sodium valproate (VPA) on bleomycin-induced pulmonary fibrosis (PF) and its mechanism. METHODS: SD rats (n=42) were randomly divided into model group and treatment group. Bleomycin at dose of 5 mg/kg was intratracheally injected to establish a rat PF model. The rats in treatment group were given normal saline (NS, 0.5 mL/d), VPA (300 mg·kg-1·d-1) or dexamethasone (DEX, 0.6 mg·kg-1·d-1) via intraperitoneal injection from the 14th day to the 28th day after modeling. The rats in model group were sacrificed on 0 d, 14 day and 28 d after modeling . The rats in treatment group were killed at 14th day after treatment. The effects of VPA on PF were evaluated by HE and Masson staining. The hydroxyproline (HYP) content in the rat lung tissues was detected, and the expression of α-smooth muscle actin (α-SMA) and E-cadherin was determined by Western blotting. RESULTS: HE staining showed that the alveolar structure and interstitial morphology in VPA group were better than those in NS group and DEX group. The level of collagen in VPA group was significantly lower than that in DEX group and NS group by determining the HYP content and Masson staining. VPA reduced the expression of α-SMA, a mesenchymal marker protein of PF, while increased the expression of epithelial marker protein E-cadherin. CONCLUSION: VPA reduces collagen content and distribution, and up-regulates the expression of the epithelial marker protein E-cadherin, while down-regulates mesenchymal marker protein α-SMA, thereby preventing the rat lung tissues from bleomycin-induced PF.

Pulmonary fibrosis; Bleomycin; Sodium valproate; α-smooth muscle actin; E-cadherin

1000- 4718(2015)03- 0552- 05

2014- 10- 27

2015- 01- 07

国家自然科学基金资助项目(No. 81273957)

△通讯作者 Tel： 0546-8776590; E-mail: fengtao1972@163.com

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.030