扰乱昼夜节律对小鼠角膜创伤修复的影响*

刘 鹏， 刘 俊， 薛芸霞， 宋 方， 王寒晴， 傅 婷， 夏潮涌， 李志杰, △

(暨南大学 1再生医学教育部重点实验室， 2医学院眼科研究所， 3医学院组织学与胚胎学教研室，广东 广州 510632)



扰乱昼夜节律对小鼠角膜创伤修复的影响*

刘 鹏1， 刘 俊1， 薛芸霞2， 宋 方1， 王寒晴1， 傅 婷2， 夏潮涌3， 李志杰1, 2△

(暨南大学1再生医学教育部重点实验室，2医学院眼科研究所，3医学院组织学与胚胎学教研室，广东 广州 510632)

目的： 本研究旨在观察昼夜节律对角膜创伤修复的影响。方法: 选用C57BL/6雄性小鼠，在小鼠角膜中央直径为2 mm的圆形区域，用高尔夫样刀机械性去除其上皮层，使用荧光素钠显色创伤面积，动态观察上皮层修复的动力学，并观察白细胞、血小板和分裂细胞的动态变化。结果: 全昼(12 h light/12 h light, LL)和全夜(12 h dark/12 h dark, DD)组角膜创伤修复速率小于对照组(12 h light/12 h dark, LD)，表现为再上皮化延迟、上皮细胞数量降低、血管扩张直径增大、白细胞和血小板募集的发生延迟，但白细胞和血小板数目显著增多。结论: 扰乱昼夜节律延迟炎症反应的发生，但加剧炎症反应；延迟再上皮化过程，最终显著抑制角膜创伤修复过程。

角膜； 昼夜节律； 创伤修复； 炎症反应

角膜上皮修复是一个复杂的过程，包括损伤区域的炎症反应，细胞的增殖、迁移。具体过程为：角膜上皮损伤触发炎症反应，血管内皮发生明显的功能和形态的改变，血管内皮表面表达特异性黏附分子使血管黏附性增加，从而诱导白细胞从角膜缘血管渗出，并迁移到损伤区域清除死亡、坏死的组织；伴随着炎症的消退，角膜快速再上皮化，白细胞的数目恢复至正常水平，基底细胞重新填充角膜基质[1]。

昼夜节律是生物为适应外界环境的昼夜变化，使机体活动产生约为24 h周期变化的生理现象。在哺乳动物中，昼夜节律系统由下丘脑视交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)和外周组织的外周时钟构成。SCN是昼夜节律的起搏点，可调控自身组织节律，还可通过神经递质、内分泌、体液等途径影响外周时钟。外周时钟存在于心脏、肝脏、肾脏和肺等几乎所有的组织器官中[2]。SCN协同外周时钟使哺乳动物的昼夜节律与环境保持同步，保证生理活动协调。同其它外周组织和器官一样，眼组织的许多生理活动也表现出昼夜节律性。临床数据表明：眼内压[3]、眼轴长度[3]、脉络膜厚度[4]呈日周期变化。但有关角膜昼夜节律的研究非常少。早期初步的研究显示，角膜厚度节律性改变[5]，在睡眠期角膜厚度增大，觉醒后数小时内角膜厚度急剧变小。放射自显影技术显示，在大鼠中，角膜上皮细胞DNA的合成呈周期性变化，在6：00～12：00出现波峰，在20：00出现波谷[6]。

扰乱昼夜节律增加了疾病的发生概率。改变人的作息时间容易造成新陈代谢紊乱、心血管疾病的发生[7]，轮班工作增加患癌症、糖尿病、中风的风险[8]。大鼠败血症模型中，全昼(12 h light/12 h light, LL)和全夜(12 h dark/12 h dark, DD)条件下的大鼠比昼夜(12 h light/12 h dark, LD)条件下存活率低[9]。这些研究提示正常昼夜节律有抵抗疾病的作用，其原因可能是机体能预测外界日周期的变化。角膜是视觉系统感受外界光线刺激过程中最重要的屈光装置之一，直接与外界接触极易发生外伤性损害，因此，了解角膜组织生理活动的昼夜节律对角膜创伤修复具有重要意义。

本文研究昼夜节律对角膜创伤修复的影响，分别观察了正常昼夜节律和扰乱昼夜节律条件下角膜上皮修复的动力学，以及观察炎性白细胞、血小板和分裂细胞的动态变化。

材 料 和 方 法

1 实验动物与主要试剂

6～8周龄C57BL/6雄性小鼠，体重18～22 g，购于广东省实验动物中心，使用过程严格遵守ARVO申明和暨南大学实验动物委员会的有关规定。

PE直标的大鼠抗小鼠CD31、CD41抗体以及FITC直标的大鼠抗小鼠CD41、Gr-1抗体均购自BD；DAPI染色液购自碧云天生物试剂公司；水合氯醛、荧光素钠、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和Triton X-100购自广州斯佳生物技术有限公司；环钻和高尔夫样刀购自Accutome。

2 方法

2.1 动物处理 参照文献[10]，LD组小鼠7:00～19:00接受光照(光照强度300 lux)，19：00～次日7：00停止光照，LL组24 h光照(光照强度300 lux)，DD组24 h黑暗，在(24±2) ℃的清洁级环境中饲养至少12 d，饲养过程中自由进食。

2.2 角膜创伤动物模型 参照文献[11]，腹腔注射10%水合氯醛(0.05～0.1 mL)麻醉小鼠。解剖镜下使用环钻在角膜中央标记直径为2 mm的圆形区域，采用高尔夫样刀机械性刮除标记区的上皮细胞层，在此过程勿损伤基质层。创伤后不同时点使用荧光素钠染色显示创伤面积，获取图像并分析创伤修复动力学。

2.3 免疫荧光标记 获取具有完整角膜缘的角膜组织，依次在2%甲醛固定40 min、2% BSA封闭15 min、0.2% Triton X-100透膜15 min，再用FITC直标的Gr-1、PE直标的CD31、PE直标的CD41单抗分别标记白细胞、角膜缘微血管、血小板，所有抗体均以1∶50稀释。为使铺片平整，将角膜径向切割成4片，用含DAPI的抗荧光淬灭缓冲甘油封片剂封片，同时可用来分析细胞形态和细胞增殖情况。

2.4 定量分析 每组实验至少选取5个角膜统计角膜上皮分裂细胞数目、白细胞数目、血小板数目、血管直径。血管直径、血小板数据的获取：在40倍物镜下随机选取角膜缘血管网8个不同的视野并拍照；角膜上皮分裂细胞、白细胞数据的获取：在均分角膜的4条直径上，用40倍物镜均匀获取9个视野并拍照，累计每条直径上的细胞总数。用Image-Pro Plus 5.1软件测量血管直径和统计白细胞、分裂细胞、血小板数目。

3 统计学处理

用SPSS 13.0 统计软件分析数据。数据用均数±标准差(mean±SD)表示，采用t检验比较各组数据的差异性，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 角膜创伤动力学

LD、LL和DD组在同一时点创伤，在创伤后0 h、12 h、18 h、24 h用上述方法统计创伤面积。3个组的创伤区域均在创伤后24 h愈合，但LL和DD组的创伤面积在创伤后12 h、18 h显著大于LD组(P<0.01)，见图1A、B。

此外，在创伤后0 h、6 h、12 h、18 h、24 h，统计LD、LL、DD组角膜上皮分裂细胞数目。LL组在创伤后12 h、18 h分裂细胞数目显著少于LD组(P<0.01)；DD组在创伤后12 h、18 h、24 h分裂细胞数目也显著少于LD组(P<0.01)，见图1C、D。

Figure 1.Dynamics of corneal wound healing. A: the stages of re-epithelialization revealed by fluorescein staining at 0 h, 12 h, 18 h and 24 h after central epithelial abrasion; B: percentage of the original wound area was plotted over time and was calculated from the area of fluorescein staining at each time point; C: dividing cells (arrows) stained with DAPI to reveal chromatin in the cornea; D: epithelial cell division counted after abrasion each 6 h. Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs LD group.

2 扰乱昼夜节律对血管直径的影响

LD组在整个创伤修复过程中，动、静脉直径没有发生显著变化。LL和DD组在创伤后6 h、12 h、18 h动脉和静脉显著扩张，表现为：LL组动、静脉血管直径在创伤后6 h急性扩张，均在创伤后6 h达到最大值，直到创伤后18 h静脉血管持续处于最大扩张状态；DD组动、静脉血管在创伤后6 h则缓慢扩张，动、静血管分别在创伤后18 h、12 h达到最大值，见图2。

3 扰乱昼夜节律对血小板募集的影响

LD组血小板数目在创伤12 h达到最大值，之后下降并趋于稳定，其数目均处于较低水平。LL和DD组在创伤后6 h角膜缘血小板的数目显著少于LD组(P<0.01)，之后LL和DD组血小板数目开始急剧增加，创伤后12 h、18 h和24 h的数目显著大于LD组(P<0.01)，均在创伤后12 h达到最大值，见图3。

4 扰乱昼夜节律对角膜白细胞数目的影响

在创伤后0 h、6 h、12 h、18 h、24 h，分别统计了整个角膜白细胞的数目。在创伤后6 h，LL和DD组白细胞数目少于LD组(P<0.01)；但在创伤后12 h、18 h，LL和DD组白细胞数目显著多于LD组(P<0.01)；创伤后24 h，LL组白细胞数目多于LD组(P<0.05)，DD组白细胞数目少于LD组(P<0.05)。LL组白细胞数目在创伤后18 h达到最大值；DD组在创伤后12 h达到最大值，见图4。

Figure 2.Effects of disruption of circadian rhythms on the vascular diameter in corneal limbus. A: changes of the arteriole diameter after corneal epithelial abrasion; B: changes of the venule diameter after abrasion; C: fluorescence microscopy image of the vessel stained with anti-CD31-PE. A is arteriole and V is venule, respectively. Mean±SD. n=5. *P<0.05, **P<0.01 vs LD group.

Figure 3.The effect of disruption circadian rhythms on platelets in corneal limbus. A: the number of platelets in corneal limbus after abrasion; B: the image of the platelet and blood vessels. Platelets were stained with anti-CD41-PE antibody in red, and blood vessels were stained with anti-CD31-FITC antibody in green. Mean±SD. n=5. **P<0.01 vs LD group.

Figure 4.The effect of disruption circadian rhythms on neutrophils in cornea. A: dynamics of neutrophils in cornea after central epithelial abrasion; B: fluorescence microscopy image of the neutrophils stained with anti-Gr-1-FITC. Mean±SD. n=5. *P<0.05, **P<0.01 vs LD group.

讨 论

本研究表明扰乱昼夜节律后，小鼠角膜创伤修复速率延缓，表现为：再上皮化延迟、上皮细胞数量降低、血管扩张直径增大、白细胞和血小板募集的发生延迟但募集数目过度增加。

在眼组织中，眼内压[3]、脉络膜厚度[4]、角膜厚度[5]、眼轴长度[3]等呈日周期变化。放射自显影研究显示角膜上皮细胞DNA合成存在节律性[6]，斑马鱼肠道细胞分裂具有节律性[12]。角膜缘区的干细胞对创伤十分敏感，可以迅速进入细胞分裂期来提供基底细胞。当上皮细胞受到损害时，基底细胞可迅速进行分裂补充创伤区域，完成再上皮化过程。本实验结果表明，扰乱昼夜节律创伤后角膜上皮分裂细胞数目降低，即细胞分裂速率减慢。因此，昼夜节律紊乱是直接影响角膜上皮细胞分裂速率的部分原因。

正常的昼夜节律是免疫系统发挥功能的必要条件，昼夜节律紊乱会影响免疫系统的功能。炎症反应是组织创伤后完成修复的一个必经过程[13]，包括微血管结构与功能的变化、血小板和白细胞的募集。为了得到更多证据，我们进一步研究了昼夜节律对炎症反应的影响。

微血管是整个炎症反应发生和维持的关键部位。在创伤早期，炎症因子和其它因子刺激血管扩张、血管内皮细胞间隙扩大、黏附分子表达增加等，促使炎症细胞向创伤区域迁移和募集[14]。本实验结果显示，扰乱昼夜节律血管直径显著扩张。因此，我们推测扰乱昼夜节律会加剧炎症反应。此外，血管直径的变化必然会引起与之相关的调节因子如血小板的变化。

血小板是炎症反应中的循环哨兵，受到刺激后能在短时间内释放大量的趋化因子和免疫调节因子等炎症反应因子[15]。目前已知血小板在炎症反应中的功能有：(1) 直接调节炎症细胞的活性；(2) 直接黏附在血管壁上调节血管内皮细胞活性进而为白细胞提供更多附着位点；(3) 参与病原体的捕获、隔离；(4) 直接杀死病原体。最近研究发现，在角膜创伤后炎症反应期间，血小板参与白细胞在角膜缘血管的黏附、迁移、募集过程，并参与角膜创伤后再上皮化和上皮细胞增殖过程[15]。实验结果表明，扰乱昼夜节律角膜缘血小板募集的发生延迟，但募集的强度增加。验证了上述推测，扰乱昼夜节律加剧了炎症反应。有文献报道血小板与白细胞在角膜发生聚集的速率和强度具有一致性[16]。因此，我们推测白细胞在创伤修复过程中具有类似的过程。

白细胞被称为人体的“卫士”。当组织受到损伤或者病菌入侵，白细胞能通过变形而穿过毛细血管壁，聚集至损伤或被入侵部位[17]。白细胞的主要作用是：(1) 分泌化学物质和酶类杀死微生物和清除受损、坏死组织，为上皮细胞的迁移提供一个相对“干净且无菌”的环境；(2) 释放趋化因子和生长因子，触发并维持后期的炎症反应与修复过程。本实验结果显示扰乱昼夜节律延迟白细胞往角膜组织迁移的发生，但增加了白细胞的数目。进一步验证扰乱昼夜节律会加剧炎症反应。

扰乱昼夜节律会影响免疫系统的功能。许多文献进行了相关报道，昼夜节律紊乱的小鼠外周组织巨噬细胞炎症因子的分泌量增加，受LPS刺激死亡率更高[18]；扰乱小鼠昼夜节律，发现有更多的TH17细胞生成并大量聚集在肠道中[19]；在小鼠活跃期，对病原体及其产物高度敏感，把处于活跃期的小鼠暴露在强光下，可导致小鼠发生过敏反应降低其存活率[20]。这些研究证实了昼夜节律紊乱会导致免疫功能失调，加剧炎症的发生，但其机制没有完全研究清楚，可能的原因有：(1) 昼夜节律紊乱导致黏附分子和趋化因子分泌量增加，促进白细胞流入组织中，而过多活跃的白细胞进入组织易导致组织损伤；(2) 扰乱昼夜节律会干扰小鼠在不同时期对发现和消灭病原体的反应灵敏度，也会影响免疫成分的表达；(3) 白细胞在不同时间吞噬能力和细胞毒性不同。

综上所述，扰乱昼夜节律从2个方面影响角膜创伤修复过程：(1)直接影响上皮细胞的分裂速率；(2)干扰炎症反应，主要表现为炎症反应的发生延迟且反应强度增强。这些影响最终抑制角膜创伤修复过程。但昼夜节律系统是如何协调角膜创伤修复的各个过程以及分子机制，需要进一步深入的研究。

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Disruption of circadian rhythms inhibits wound healing of corneal epithelium in mice

LIU Peng1, LIU Jun1, XUE Yun-xia2, SONG Fang1, WANG Han-qing1, FU Ting2, XIA Chao-yong3, LI Zhi-jie1, 2

(1KeyLaboratoryforRegenerativeMedicine,MinistryofEducation,2InstituteofOphthalmology,3DepartmentofHistology&Embryology,SchoolofMedicine,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:zhijielee@yahoo.com)

AIM: To observe the effect of circadian rhythms on wound healing of mouse corneal epithelium. METHODS: The C57BL/6 male mice were used in the study. A part of corneal epithelium (2 mm in diameter) was struck off by a golf-like knife to form a round wound area. The dynamics of epithelial healing in the wound area were observed under microscope with fluorescein staining. In addition, with related antibodies and DAPI, the dynamic changes of the neutrophils, platelets and dividing cells were also investigated. RESULTS: The healing rates in LL group (12 h light/12 h light) and DD group (12 h dark/12 h dark) were obviously slower than that in LD group (12 h light/12 h dark), mainly showing delayed re-epithelialization, decreased epithelial cells, increased diameter of blood vessel, and delayed recruitment of neutrophils and platelets, but more cell number. CONCLUSION: Disruption of circadian rhythms significantly inhibits the wound healing of corneal epithelium, mainly through delaying the inflammation and re-epithelialization, but aggravating the inflammatory responses.

Cornea; Circadian rhythms; Wound healing; Inflammation

1000- 4718(2015)03- 0499- 06

2014- 12- 09

2015- 01- 22

国家自然科学基金资助项目(No. 30672287；No. 30772387；No. 81070703)

△通讯作者 Tel: 020-85226413； E-mail: zhijielee@yahoo.com

R363; R779.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.020