液态活检技术的发展及肿瘤领域的应用

陈颖 朱明华

·述评·

液态活检技术的发展及肿瘤领域的应用

陈颖 朱明华★

广义而言，液态活检是指以血液为主的体液标本中细胞及核酸的检测，包括了循环肿瘤细胞和游离DNA两大类。液态活检属于新型的无创性分子病理检测方式，具有广阔的临床应用前景；对于传统病理学而言，液态活检的出现既是机遇也是挑战。本文主要从分子检测技术以及临床应用价值这两方面综合阐述了液态活检作为一种新的非侵入式的检测方法在临床肿瘤早期诊断、筛查等领域的发展前景及面临的挑战。

液态活检；非侵入式检测；分子检测

组织病理学是在显微镜下直接观察病变组织的形态学改变，因而病理诊断被誉为是疾病诊断的“金标准”，在临床诊断中具有不可动摇的地位［1］。随着分子生物学研究日益发展，人类对疾病的认识也不再局限于表型和形态学，根据肿瘤发生的分子机制，形成了分子病理学。分子病理学的研究对象十分广泛，包含了组织、细胞和体液，而“液态活检”（liquid biopsy）就是其中的重要分支之一。

“液态活检”这一概念最早在1974年由Sorrells等［2］提出，当时指关节腔的滑液分析用于诊断滑膜疾病。液态活检的标本来源主要为以血液为主的体液，其中包括胸水、腹水等其他体液成分，而血液是最容易获得的临床标本。本文详细总结了液态活检的对象、方法和应用领域，旨在为肿瘤的诊断和治疗提供新的手段，为病人的预后和转归提供新的依据。

1 液态活检的研究对象

液态活检的研究对象主要包括外周血循环中存在的循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）和游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）两大类。

1.1 循环肿瘤细胞

CTCs的概念雏形最早于1869年由Ashworth提出［3］。当时Ashworth设想，血液循环中可能存在与原发病灶性质相同的肿瘤细胞，而这正是患者体内肿瘤的播散机制。越来越多的研究证实肿瘤患者的外周循环中存在以小簇、团状形式存在的肿瘤细胞，现在认为CTCs是恶性肿瘤出现血路转移的主要生物学基础，其数量的多少与患者的预后关系密切［4］。早期关于CTCs的研究主要集中于乳腺癌，30％～40％左右的乳腺癌患者的外周血或骨髓中可以检测到CTCs，尤其在缺乏明确淋巴结及远处器官转移、临床分期早期患者的体内就存在，是预测患者未来发生转移的独立预后因素［5］。随着肿瘤特异性标记物应用的广泛开展和检测敏感性的提高，在许多恶性肿瘤如肺癌［6］、胰腺癌［7］、前列腺癌［8］、膀胱癌［9］、大肠癌［10］等中均能发现CTCs，而且检出率也要远远高于上述的比例，甚至还有学者将CTCs形容为实体瘤的“白血病样”阶段（leukem ic phase）［11］。肿瘤进展过程中，肿瘤细胞通过基因突变或表观遗传学改变等而获得了更具侵袭能力的生物表型或干细胞特性，其中上皮－间叶转化（epithelial tomesenchymal transition，EMT）被认为是CTCs出现的主要机制之一［12］。由此看来，CTCs与其起源的原发病灶中的肿瘤细胞虽然相似，但是两者之间并不存在完全相同基因谱或表达谱系。大量的临床试验均证实，CTCs具有很强的预后判断和转移预测价值［13］，因此通过研究CTCs的生物学和遗传学特性相较于原发灶具有更丰富的临床指导意义。

1.2 循环肿瘤DNA

1948年Mandel和Metais［14］在人类血循环中发现了游离DNA的存在，称之为“Cell-free DNA”（cfDNA）。此后，cfDNA的检测开始增多，尤其是作为无创性检测手段（non-invasive prenatal testing，NIPT）应用于高危孕妇的产前诊断，比如唐氏综合症［15］、先兆子痫［16］等。

目前发现肿瘤患者的外周血中也能检测到游离核酸（cell-free nuclear acids，cfNAs）的存在［17］，认为是由肿瘤细胞产生的，其中以基因组和线粒体DNA成分为主，也被称为循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），其他还包括RNA和m icroRNA。肿瘤细胞可以是来自组织中的病灶，也可以来自外周血或骨髓中存在的微转移癌栓或CTCs［18］。肿瘤细胞产生ctDNA主要通过被动和主动机制2种途径来完成。被动机制是指凋亡和坏死的细胞会释放出细胞核和线粒体DNA进入血液循环［19］。在正常生理情况下，释放的DNA数量不多，单核巨噬细胞能及时清除坏死和凋亡细胞的碎片，因此正常人群外周血中的游离DNA含量几乎测不出来。而肿瘤患者体内由于肿瘤细胞生长快速，坏死和凋亡的细胞数目明显增加，释放的DNA数量也多，再加上肿瘤免疫功能的紊乱，不能及时清除，因而造成较多的ctDNA进入外周血循环［20］。主动机制则是指肿瘤细胞能主动释放DNA到外周循环之中。研究发现，在前列腺癌［18］、肺癌［21］、乳腺癌［22］、大肠癌［23］、肝癌［24］、膀胱癌［25］、宫颈癌［26］、胰腺癌［27］、卵巢癌［28］等人类恶性肿瘤中均能检测到ctDNA。外周血中提取得到的ctDNA包含了编码和非编码DNA，可以用于肿瘤相关基因的遗传学和表观遗传学研究，如基因突变、异常扩增、杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）、微卫星不稳定性（m icrosatellite instability，MSI）、特异性靶点标记、表达谱分析、m iRNA研究、染色体分析以及甲基化等，用于指导临床用药、判断预后、化疗效果评估、耐药性检测、监测病程进展以及复发转移的预测等方面。

2 常用检测技术

2.1 CTCs分离、富集相关技术

2.1.1 免疫磁珠富集法（immunomagnetic beads separation，IMS）

IMS技术基于细胞表面的抗原与连有特异性抗体的磁珠相结合，并在外源磁场的作用下富集细胞，其根据分离的策略可以分为阳性富集法和阴性富集法两大类。阳性富集法是指磁珠结合得到的细胞就是所需要的细胞。目前唯一已获得美国食品药品监督局（Food and Drug Adm inistration，FDA）批准上市的CELLSEARCH®循环肿瘤细胞检测试剂盒就是针对细胞表面的上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesionmolecule，EpCAM）来分离CTCs。该试剂盒提出了具有临床预后判断意义的CTCs的检出数目：转移性乳腺癌和前列腺中，CTCs数目小于5个／7.5m L外周血表明患者预后较好；转移性大肠癌中，CTCs数目小于3个／7.5

m L外周血表明患者预后较好。根据CTCs的含量与临床预后的关联其他还在研究阶段的磁珠包被标记物如广谱标记物（全角蛋白）和其他肿瘤类型相关标记物如CerBb2、Mucin、AFP等。此外，用于分离CTCs的标记物除了蛋白质类标记物，还包括了mRNA和端粒酶类的标记物［29］，提高了CTCs的检出效率。但是肿瘤相关的标记物的种类非常繁杂，并没有一个标记物能“放之四海而皆准”。基于这些情况产生了阴性富集法。所谓阴性富集法是指磁珠结合得到的细胞不是所需要的细胞，主要应用了针对白细胞的广谱标记物CD45，在磁场作用中剔除了有核细胞游中的白细胞，其中未被结合的细胞就是所需要的CTCs［30］，能大大增加CTCs的检出数量。但是免疫磁珠法仍然受到标记物的限制，由于肿瘤细胞与正常细胞存在交叉抗原表达，并且肿瘤细胞本身存在显著异质性，同一个患者得到的CTCs并不会表达一致性的标记，因此容易出现假阳性或假阴性的结果。

2.1.2 CTCs芯片技术

2007年，麻省总医院开发了第一代CTCs芯片，能从外周血中分离得到CTCs［31］。第一代CTCs芯片是基于微流体学原理，以微阵距的方式将针对CTCs细胞表面标记物——EpCAM的抗体包被在芯片上，当血液样本通过芯片时，就能通过抗体将其中的CTCs细胞捕获下来。经过验证，Nagrath等发现该芯片技术能高效地获取99％的转移性乳腺癌、肺癌、胰腺癌以及结肠癌患者外周血中的CTCs，捕获的细胞数目范围在5个～1 281个细胞／m L［31］。2010年，Stott等在第一代CTCs芯片的基础上经过改良，研发了第二代芯片，因为其阵距类似鱼骨样，因此被称为鲱鱼骨芯片（herringbongchip，HB-chip）［32］。与第一代平板型的芯片不同，第二代根据微流体涡流原理设计了弯道型的内槽，增加了细胞与包被抗体时间的接触时间，显著提高了CTCs的获取效率。因为第二代芯片表面设置的是透明的外壳，因此在芯片上还能进行各种原位检测，如苏木素-伊红染色、免疫荧光染色等，透过芯片通过显微镜能直观地观察CTCs的形态学特征和染色结果。但是由于目前报道较少，CTCs芯片尚需要得到大规模样本的验证才能真正投入临床应用。

2.1.3 密度梯度离心法（density gradient centrigate，DGC）

DGC技术基于CTCs与有核白细胞具有不同的漂浮系数的原理，在等渗溶液中提取CTCs。商品化的等渗溶液有LymhoPrepTM、Ficoll-HyPaqueTM、OncoquickR等产品。StemCell公司开发的Rosette-SepTM人类循环上皮类肿瘤细胞试剂盒在密度梯度离心的基础上还添加了针对白细胞的抗体四聚体以增加其沉降效率，减少白细胞对CTCs的干扰。这些检测方法仍然存在灵敏度较低的缺陷，无法捕捉到少量、稀有的CTCs。

2.1.4 滤过膜分离法（filtermembrane filtration，FMF）

FMF技术基于CTCs的细胞体积显著大于白细胞的原理，采用一定孔径的滤过膜将CTCs从血液中分离出来，也被称为膜滤过分离肿瘤细胞技术（isolation by size of epithelial tumor cells，ISET），每毫升血液中可以提取到至少1个肿瘤细胞［33］。由于ISET法分离CTCs主要基于细胞的体积而不是细胞表面的相关抗原，因此主要适用于异质性明显的恶性肿瘤如肺癌、胃癌和前列腺癌等，大大降低了由于抗原交叉表达或差异表达而导致的假阳性率［34］。但正因为如此，ISET法只能分离得到体积较大的CTCs，对于那些体积较小的CTCs就容易滤过，从而得到假阴性的结果。研究者［35］研发了一种结合滤过膜和微机电原理的CTCs分离及原位电裂解系统（m icro-electro-mechanical system／MEMS-based in situ cell lysis），其能更高效地分离CTCs并及时抽提细胞基因组DNA。

2.1.5 基于流式细胞仪的CTCs富集法（flow cytometry-based CTCs enrichment，ImageStream®）

该方法主要针对肿瘤细胞表面特异性抗原并应用流式细胞仪的细胞分选技术筛选分离得到表达相应标记物的CTCs，可选用的标记物包括了角蛋白（cytokeratin）、CA19-9、甲胎蛋白、癌胚抗原、表皮生长因子受体等多种肿瘤相关分子。同样，由于肿瘤细胞与正常细胞之间的交叉抗原表达，这种CTCs的富集方法也受到了标记物的限制，容易出现假阳性的结果，不能完全保证CTCs的纯度。

2.2 ctDNA分离及检测技术

2.2.1 ctDNA分离技术

ctDNA由于片段较小、含量很少，而且容易和

血浆蛋白相结合，因而常规的提取效率都不高。针对血浆中ctDNA的抽提原理主要有四大类：盐析法、酚-氯仿抽提法、微柱吸附法和磁珠吸附法。目前商品化的试剂盒绝大多数都是基于以上后两种原理研发的。而传统的盐析法和酚-氯仿法由于操作步骤复杂、需要使用有机溶剂、ctDNA的提取效率较低，现在基本上已经不再使用了。通过比较各类试剂盒发现，磁珠法获得的ctDNA在质量和含量上都要优于微柱吸附法，假阳性率也较低［36］。

2.2.2 ctDNA检测技术

ctDNA研究的关键技术是如何从外周血中分离得到足够量的、高质量的游离DNA，相对而言该检测技术比较简单。ctDNA检测技术根据检测目的来选择相应的技术方法，其中大部分是以PCR技术为基础，如实时荧光定量PCR、甲基化特异性PCR等，也有基于微珠富集原理的方法［36］。目前，ctDNA检测技术已经广泛地应用于K-ras、BRAF、HER-2、p53、EGFR、APC等肿瘤靶向治疗、诊断及预后相关标记的检测。尤其是新一代测序技术飞速发展的今天，基于ctDNA的全基因组测序、全外显子测序或全转录本深度测序方法将逐渐替代原来传统的基因突变或测序方法，也将探索出越来越多的肿瘤相关片段，如耐药、恶性生物学行为等方面。

3 临床应用价值

3.1 临床疗效监测

由于ctDNA和CTCs的分离和检测属于无创性检测手段，从外周血中提取即能实现，因此很适合临床上用于监测肿瘤患者的疾病发展及对药物治疗的反应性以及耐药情况，尤其是药物靶向治疗。肿瘤细胞在药物作用过程中会通过表型和基因改变形成耐药性克隆而产生继发性耐药现象，目前看来，这是影响药物治疗效果的主要原因。研究者对乳腺癌、卵巢癌和肺癌患者在接受常规化疗的不同时相的外周血中游离DNA进行了全外显子测序，从中筛选得到了一系列基因的改变，如PIK3CA、EGFR（耐药相关突变T790M）、RB1等基因的突变，可以以此作为监测化疗疗效的良好靶标［37－38］。

3.2 预后判断及临床分期

早期诊断、准确分期以及治疗监测是临床肿瘤学中的重要内容。以往的TNM（tumor，nodal metastasis和distantmetastasis）分期主要是基于肿瘤的临床特征，如肿瘤大小、侵犯周围组织的情况、淋巴结和远处器官转移情况。组织活检由于对病人造成一定程度的创伤，往往不能反复多次进行。肿瘤的原发灶和转移灶之间存在遗传学、表观遗传学甚至转录组学的差异。利用外周血中的CTCs或ctDNA能更准确、更高效评估肿瘤的进展，尤其是对于那些不宜进行活检的患者。

2012年美国癌症联合委员会（American Joint Comm ittee on Cancer，AJCC）重新修订了乳腺癌的TNM分期标准，将“缺乏临床或影像学证据证实的远处转移、但在外周循环、骨髓或其他远处组织内通过分子生物学或显微镜观察确定存在的、小于0.2mm的转移灶定位cM 0（i＋）期”，确定了CTCs及ctDNA的重要临床意义。

研究表明，外周血中出现高频的肿瘤相关基因突变如p53、KRAS和APC等，往往与较高的临床分期有关，也预示着患者较差的预后［39］。研究者根据检测结肠癌患者经过化疗后血浆ctDNA中相关基因突变情况，筛选了一套用于预后相关的突变基因谱，认为能近乎100％地预测患者的复发情况［36］。2014年，斯坦福大学的研究者提出了一种基于NimbleGen基因序列捕获技术的ctDNA深度测序检测方法，称为癌症个体化深度测序分析方法（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）。该项技术主要根据已知的肿瘤基因突变数据库中通过生物信息学筛选得到与肿瘤复发相关的基因，将这些基因的突变区域定制了靶向序列捕获的筛选器，并在此基础上进行深度测序［40］。研究者认为应用CAPP-Seq技术分析外周血中分离得到的ctDNA，能准确确定患者的基因型，检测结果与常规活检标本得到的结果没有差别，该技术也有望能取代组织学活检而成为肿瘤基因检测的金标准。目前，ctDNA或CTCs能否作为肿瘤复发的检测指标而广泛应用于临床还有赖于大样本、多中心的临床试验进一步证实。

3.3 肿瘤个体化治疗靶标

实体肿瘤具有明显的细胞异质性，不同的肿瘤患者之间同样也具有明显的异质性，对放化疗的反应均不相同，尤其是随着分子靶向药物的应用，令这种个体差异性与套餐式的治疗策略之间的矛盾日益突出。根据每个肿瘤患者的“个性”制定个体化的治疗方案已经成为了肿瘤辅助治疗的必然发展方

向。相对于有创性组织活检，检测肿瘤患者外周血或体液中的CTCs或ctDNA的途径就非常简便，可以做到随时取样、随时监测，也不会造成医源性播散。研究者开发了基于新一代单分子测序手段的GUARDANT360技术，通过检测恶性肿瘤患者血液里ctDNA的基因型来判断临床预后以及化疗效果［41］。

4 小结和展望

相较于传统的组织活检或固相活检，液态活检的优势十分明显。由于样本来源是体液，尤其是血液，临床获得样本途径非常简便，可以做到随时取样、随时监测，也不会造成医源性播散。但是液态活检有一定的局限性。其一，对于ctDNA而言，ctDNA由于存在于外周循环中，含量很低，而且容易受到循环中非肿瘤细胞来源的野生型核酸的稀释干扰，降低了检测手段的敏感性；对于CTCs，需要找到合理配伍的肿瘤细胞标记物，增加CTCs的检出效率。其二，进行ctDNA和CTCs分析之前的样本收集、处理等环节必须标准化，以降低各实验室之间的差异。其三，应用CTCs和ctDNA用于预测临床转移、复发，尤其对于M 0分期、临床没有明确转移的患者，设定其外周血中CTCs和ctDNA的含量的阈值。

目前液态活检仍处于研究的初级阶段，尚需要大量大规模、多中心的研究进一步证实其临床应用价值。以形态病理学为基础，以分子病理学为辅助，两者相辅相成，液态活检将为人类更深入地了解疾病的本质提供更丰富的、可靠的手段。

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Recent advances of liquid biopsy and its application in medical oncology

CHEN Ying,ZHU M inghua★
(Department of Pathology,Changhai Hospital,Second M ilitary Medical University,Shanghai,China,200433)

Liquid biopsy refers to the analyses of circulating tumor cells or cell-free fragments of DNA thatmainly exist in the bloodstream and other body fluid.Liquid biopsy is a novel kind of non-invasive technique and has a w ide prospect of clinical application in the molecular pathological field.The occurrence of liquid biopsy is both an opportunity and challenge towards traditional histopathology.In this paper, the advances in the emerging new techniques of liquid biopsy and its clinical application values in the field of cancer care,including prognosis assessment,early cancer screening and prediction of treatment responses w ill be reviewed.

Liquid biopsy；Non-invasive analysis；Molecular test

国家自然科学基金（81172310）

第二军医大学附属长海医院病理科，上海200433

★通讯作者：朱明华，E-mail：mhzhu2000＠hotmail.com