生脉饮复方制剂对病毒性心肌炎细胞凋亡作用的研究

熊丽辉+孙大中

doi：10.3969/j.issn.1007-614x.2014.22.3

摘要目的：研究生脉饮对病毒性心肌炎心肌细胞凋亡作用的影响。方法：用柯萨奇B病毒建立感染的心肌细胞模型，在感染后24小时将细胞分为正常对照组、病理模型组、生脉饮组和辅酶Q10组。4组分别在不同时间点观察细胞形态，并采用TUNEL法进行细胞凋亡的检测。结果：在48小时点开始检测，正常对照组无细胞凋亡，生脉饮组及辅酶Q10组均有凋亡，生脉饮组凋亡率低于辅酶Q10组（P<0.05），病理模型组随着时间的推移，凋亡率增加，72小时点明显高于48小时点（P<0.01），与药物干预组比较差异具有统计学意义（P<0.05）。结论：生脉饮能够有效抑制病毒性心肌炎心肌细胞的凋亡，且应该早期干预。

关键词生脉饮；病毒性心肌炎；细胞凋亡

Study on the apoptosis effect of pulse-activating decoction compound preparation in viral myocarditis

Xiong Lihui1，Sun Dashan2

Basic Medical Colleg，Changchun Traditional Chinese Medicine University，1301171

2012 Grade Traditional Chinese medicine Professional Experimental Class，Guangzhou Traditional Chinese Medicine University（Guangzhou City，Guangdong），1301172

AbstractObjective：To study the effect of pulse-activating decoction compound preparation in myocardial apoptosis effect of viral myocarditis.Methods：Using coxsackie B virus established infectious myocardial cell model.In 24 hours after infection，the cells were divided into four groups：the normal control group，the pathological model group，the pulse-activating decoction group and the coenzyme Q10 group.The cellular morphology of four groups of cells were observed at different time points.The apoptosis was detected by TUNEL method.Results：Begin testing at 48 hours，the normal control group had no apoptosis；the pulse-activating decoction group and the coenzyme Q10 group all had apoptosis；the apoptosis rate of the pulse-activating decoction group was lower than that of the coenzyme Q10 group（P<0.05）.In the pathological model group，the apoptosis rate was increased as time goes on.72 hours point was obviously higher than 48 hours point（P<0.01）.There had statistically significant compared with the drug intervention group （P<0.05）.Conclusion：Pulse-activating decoction can effectively inhibit the myocardial cell apoptosis of viral myocarditis，and it should be early intervented.

Key wordsPulse-activating decoction；Viral myocarditis；Apoptosis

病毒性心肌炎（viral myocarditis，VM）是指病毒感染引起的心肌局限性或弥漫性的急慢性炎性病变，多由柯萨奇病毒引起。在柯萨奇病毒导致VM的病理机制研究中，越来越多的证据表明，柯萨奇病毒导致病毒性心肌炎心肌细胞凋亡，从而出现心肌坏死病变[1]。中医学认为VM属于“心悸”“怔忡”范畴，病机中多存在气阴两虚，治疗上以益气养阴为主，多采用生脉饮进行加减治疗，其组成为人参、麦冬、五味子。生脉饮治疗VM临床疗效确切，但其干预机制尚不明确，且临床上生脉饮是否应该早期应用一直是临床争议的问题。为此，本实验拟观察生脉饮对VM心肌细胞凋亡的影响，力求明确生脉饮的作用机制以及最佳时间，为临床准确使用提供参考。

资料与方法

材料：①实验动物：新生SD（Sprague-Dawlay）大鼠，1～3日龄，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供。②病毒株：柯萨奇B病毒试剂盒（Coxsackie Virus B3）。③实验药物：生脉饮注射液，辅酶Q10注射液，胰蛋白酶（1：250），Sigma；DMEM（dulbecs modified eagle）培养基，GIBCO；胎牛血清，GIBCO；牛血清白蛋白，GIBCO。④溶液配制：缓冲液：Na2HPO4·2H2O 0.06 g，KH2PO4 0.06 g，MgSO4·7H2O 0.20 g，葡萄糖1.00 g，NaCl 8.00 g，KCl 4 g，CaCl2 0.14 g，三蒸水1 000 mL。DMEM培养液：20%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/mL链霉素及谷氨酰胺。细胞消化液：由Ⅰ型胶原酶20 mg、胰蛋白酶18 mg、牛血清白蛋白10 mg、加Eagle培养基10 mL。

方法：①心室肌细胞培养：大鼠打开胸腔，取出心室肌，放入缓冲液中洗涤，剪取心室肌组织经胰酶37℃水浴消化10分钟后，1000 rpm离心，反复数次，收集沉淀的细胞。按照细胞悬液5×106/mL密度种植于96孔板，置于37℃5%CO2培养箱中培养。②CVB3感染心室肌细胞：大约72小时后，光镜下观察细胞已贴壁，将CVB3病毒株作连续10倍稀释，接种于96孔板心室肌细胞，1小时后，弃去病毒液，加入培养液。③生脉饮干预：病毒感染24小时后，分别加入药物进行干预。生脉饮干预组：每天加生脉饮、100TCID50CVB3、DMEM后继续培养；辅酶Q10组：每天加辅酶Q10、100TCID50CVB3、DMEM后继续培养；病理模型组：每天加100TCID50CVB3 + DMEM；正常对照组：常规细胞液培养。④心肌细胞形态观察：心肌细胞采用苏木素-伊红（HE）染色，光镜下在不同时间点观察每组细胞形态，尤其注意观察细胞坏死及细胞凋亡情况。⑤心肌细胞存活率的检测：MTT（用PBS将MTT配成5 mg/mL溶液）比色法测定细胞存活率。⑥心肌细胞凋亡率的检测：采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）对细胞凋亡进行检测。将细胞预处理后，按照试剂盒说明进行操作。染色后，正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡心肌细胞核呈现棕黄色，在光学显微镜下计数。方法是随机选择5个高倍视野（40×10），计算每个视野阳性心肌细胞数的比例，取平均值，计算心肌细胞凋亡百分率。

统计学处理：采用SPSS 18.0统计学软件，用t检验进行各数值之间的分析比较。

结果

细胞形态：细胞培养大约72小时后，显微镜下观察，心肌细胞成簇分布，并规律成片搏动，表明心肌细胞培养成功。病毒接种后24小时，细胞形态开始出现变化，逐渐有扁缩，搏动减弱；48小时点，生脉饮干预组、辅酶Q10组、病理模型组细胞变扁缩情况增多，以病理模型组最为明显；正常对照组细胞生长良好，数量进一步增多，满布视野。72小时点，生脉饮干预组、辅酶Q10组、病理模型组开始出现细胞有脱落，病理模型组有明显的细胞坏死；生脉饮干预组、辅酶Q10组细胞坏死不明显，生脉饮组细胞形态较24小时点有所恢复；正常对照组细胞生长良好，数量无增加。

细胞存活率：在72小时点，正常组细胞存活率100%。病理对照组随着时间的延长，存活率明显下降，72小时点存活率不足50%；生脉饮干预组存活率仍>75%，辅酶Q10组细胞存活率明显下降，大约60%。

细胞凋亡率，见表1。

讨论

细胞凋亡是指机体细胞在发育过程中，由于受到某些因素的影响，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡。细胞凋亡参与了体内多种病理过程，与疾病的发生有着密切的关系，亦与病毒性心肌炎的发生相关[2]。CVB3病毒感染心肌后，导致心肌细胞凋亡，引起心肌细胞病变，进而形成心功能障碍[3]。

本研究从细胞形态、存活率及细胞凋亡3个方面进行了实验，结果表明，柯萨奇病毒B导致心肌细胞变形、坏死，并逐步发生细胞凋亡。病理模型组，随着时间的推移，凋亡发生增加，而正常对照组在72小时未发现凋亡细胞。生脉饮主要成分为人参、麦冬和五味子，具有调节机体免疫的作用，药理研究表明具有抗氧化的能力，保护心肌细胞的超微结构，从而发挥了对心肌细胞的保护作用。由于生脉饮的免疫调节机制，我们认为早期应用生脉饮效果更佳，实验研究发现，在感染后24小时用生脉饮对感染的心肌细胞进行干预，在48小时点凋亡的减少不明显，而72小时则减少明显，说明免疫调节的发生需要一定的时间。临床应早期使用生脉饮为佳。

参考文献

[1]黎帆，余克花，莫冰，等.川芎嗪对CVB3感染小鼠心肌细胞凋亡的影响[J].南昌大学学报（医学版），2010，50（4）：14-16.

[2]曹蕾，林佳，王瑧，等.雷公藤甲素对病毒性心肌炎细胞凋亡及Fas/FasL蛋白表达的研究[J].现代生物医学进展，2012，（9）： 1636-1638.

[3]Yin XC，Peng YH，Xiao ZX.Mechanism of Fas/FasL signal transduction pathway in K562 cell apoptosis induced by diallyl disulfide[J].Journal of Experimental Hematology， 2011，19（3）：634-637.