阿托伐他汀对血管平滑肌细胞中转染的TNF-α启动子活性影响的研究

程莹+鲁永织+孙敏+张卓琦

基金项目本课题受国家自然科学基金（No.30800219，No.30670557），江苏省高校自然科学基金（No.08KJD320013）和徐州医学院院长专项人才基金（No.07KJZ26）资助

doi：10.3969/j.issn.1007-614x.2014.22.2

摘要目的：探讨阿托伐他汀（Atv）在转录水平的抗炎作用机制。方法：将构建好的含有人类TNF-α启动子的以虫荧光素酶（Luciferase）为报告基因的质粒DNA转染至体外培养的平滑肌细胞中，以AngⅡ刺激并经不同浓度的Atv处理后，通过检测Luciferase的活性来观察启动子活性的变化。结果：启动子在VSMCs中可高效稳定的表达；而经AngⅡ刺激的VSMCs中，TNF-α启动子活性较未受刺激时明显上调（P<0.05）。在VSMCs中0.1～10μmol/L的Atv可抑制经AngⅡ刺激后上调表达的TNF-α启动子活性，并且呈现剂量依赖关系（P<0.05）。结论：Atv对TNF-α启动子活性的抑制，证明了其对促炎细胞因子在转录水平的潜在抑制作用。

关键词阿托伐他汀；血管平滑肌细胞；肿瘤坏死因子；炎性反应

Study of the effect of atorvastatin on the transfection of TNF-αpromoter activity in vascular smooth muscle cell

Cheng Ying1，Lu Yongzhi2，Sun Min1，Zhang Zhuoqi1

Department of Cardiology，Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College（Xuzhou City，Jiangsu），2210021

The Second Department of Oncology，the Municipal Hospital of Qingdao City，Shandong 2660112

Fundation itemThis project was supported by the national natural science foundation of China（No.30800219， No.30670557）， the college natural science foundation of Jiangsu Province（No.08KJD320013） and dean special talent fund（No.07KJZ26）

AbstractObjective：To explore the anti-inflammatory action mechanism on transcriptional level of atorvastatin（Atv）.Methods： The plasmid DNA had luciferase as the reporter gene and human TNF alpha promoter.The plasmid DNA was transfected to smooth muscle cell in vitro culture.It was stimulated by AngⅡand disposed by different concentrations of Atv.The change of the promoter activity was observed by detecting the activity of Luciferase.Results：The promoter could highly efficient and stable expression in VSMCs.While VSMCs was stimulated by AngⅡ，TNF-αpromoter activity was obviously up-regulated than without stimulation（P<0.05）.0.1～10μmol/L Atv could inhibit the higher expression of TNF-αpromoter activity in VSMCs，and it was a dose-dependent manner（P<0.05）.Conclusion：The inhibition of Atv on the TNF-αpromoter activity proves its potential inhibition of proinflammatory cytokines at transcriptional level.

Key wordsAtorvastatin；Vascular smooth muscle cell；Tumor necrosis factor；Inflammatory response

细胞因子在机体炎性反应过程中起着关键作用，并参与多种心血管疾病的生理病理过程，包括动脉粥样硬化及心衰等[1]。目前研究较多的是TNF-α，它由多种细胞，包括巨噬细胞、血管平滑肌细胞等合成并通过自分泌和旁分泌作用，参与炎性反应[2]。阿托伐他汀为HMG-CoA还原酶选择性抑制剂，能够减低血浆胆固醇及脂蛋白水平，从而被应用于冠心病的治疗中，发挥调脂、稳定斑块等作用。近年来亦有研究发现其具有抗炎作用[3]，但其具体机制尚不明确。本研究以体外培养的VSMCs为系统，初步探讨阿托伐他汀对TNF-α启动子活性的调控作用，进而从转录水平研究其抗炎机制。

资料与方法

主要试剂：阿托伐他汀原药粉（Pfizer，美国）；胎牛血清（Gibco，澳大利亚）；高糖型DMEM（Hyclone，美国）；BCA蛋白试剂盒；BgIⅡ和MluⅠ核酸内切酶；Lipofectamine2000试剂（Invitrogen，美国）；荧光素酶试剂盒（Promega，美国）；兔抗TNF-α多克隆抗体及马抗鼠碱性过氧化物酶抗体。

实验方法：①细胞培养：大鼠平滑肌细胞培养采用组织块贴壁法，雄性SD大鼠，购自徐州医学院主校区动物房，体重150～200 g，水合氯醛经腹腔注射麻醉后，无菌状态取出胸主动脉，7～10天后待原代培养VSMCs长成“峰-谷”样形态后，收获并进行传代培养，实验采用第五代细胞。所有细胞均在含10% FBS的DMEM，5%CO2 37℃培养箱中培养。②Western Blot检测：阿托伐他汀对血管平滑肌细胞中TNF-α基因的表达的影响采用Western Blot检测。实验分为空白组、AngⅡ刺激组、AngⅡ+10μmol/L Atv组、AngⅡ+1μmol/L Atv组、AngⅡ+ 0.1μmol/L Atv组。作用24小时后，按照试剂盒操作步骤提取细胞总蛋白，根据BCA蛋白检测试剂盒步骤进行蛋白浓度测定。进行SDS-PAGE，用特异性抗TNF-α抗体进行免疫杂交检测，β-actin作为内参照，化学发光剂显色，最后对目的条带进行扫描机密度分析。每组重复3次。③质粒酶切电泳：验证其是否为含有人类TNF-α基因启动子的以虫荧光素酶（Luciferase）为报告基因的质粒DNA。按内切酶产品说明书设计的酶切体系分质粒组、质粒+MluⅠ/BglⅡ单一内切酶组、质粒+MluⅠ+BglⅡ双内切酶组进行琼脂糖凝胶电泳。④Lipofectamine2000转染质粒：VSMCs以5×104cells/well接种于24孔板，待细胞长至80～90%融合时，严格按照Lipofectamine2000试剂说明书进行转染。⑤Luciferase检测：转染步骤同上，过夜后，各组分别按要求加入10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L的Atv，30分钟后除空白组及质粒组，其余4组均加入终浓度1μmol/L的AngⅡ，作用24小时后，以50μl/孔的细胞裂解液（1×PBS，0.1%Triton X-100，蛋白酶抑制剂）收取细胞，4℃离心15分钟，取20μl上清液，以荧光素酶检测试剂盒（Promega）在FB 12Luminometer检测luciferrase活性，启动子活性即以RLU（relativelight unit）表示，由仪器直接读出测定值。

统计学处理：应用SSPS 16.0对数据进行统计学处理，实验数据用（x±s）表示，样本均数比较采用t检验或单因素方差分析（ANOVA），显著性水准P取0.05。

结果

阿托伐他汀对AngⅡ刺激下大鼠血管平滑肌细胞内TNF-α蛋白表达的影响：Western Blot结果显示，与空白组相比，经终浓度1μmol/L的AngⅡ刺激后，TNF-α蛋白表达增加；阿托伐他汀不同剂量组（0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L）均对AngⅡ刺激下大鼠血管平滑肌细胞内TNF-α蛋白表达有一定的抑制作用，其中以10μmol/L的阿托伐他汀对AngⅡ刺激下TNF-α蛋白表达的抑制作用最强，呈剂量依赖性，见图1。

TNF-α启动子在VSMCs的活性表现及阿托伐他汀对其活性影响：为进一步研究Atv抗炎作用机制，将构建好的含有TNF-α启动子基因和Luciferase基因的质粒DNA转染至体外培养的VSMCs中，以AngⅡ刺激并经不同浓度（0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L）的Atv预处理后，通过检测Luciferase的活性来观察TNF-α启动子活性的变化。结果显示：空白组无Luciferase的表达，RLU值几乎为0；AngⅡ组为经终浓度为1μmol/L的AngⅡ刺激后，激活TNF-α启动子基因，导致Luciferase活性较质粒组明显增加（P<0.01）；Atv+AngⅡ组为Atv可抑制经AngⅡ刺激后明显上调的Luciferase的表达，并且呈现剂量依赖关系（P<0.05 ），见图2。

讨论

炎性反应已经被公认为动脉粥样硬化的形成机制[4-5]，同时也使得斑块的不稳定性增加，导致斑块破裂[6]。炎性细胞及炎性因子为动脉粥样硬化斑块的重要组成部分。炎性反应介导多种危险因素参与动脉粥样硬化的形成。血管内皮受损后，促炎细胞的关键因子TNF-α可被激活，它由多种细胞，包括巨噬细胞、血管平滑肌细胞等合成并通过自分泌和旁分泌作用，发挥多种病理生理效应[7-8]。因此，多种旨在针对TNF-α的治疗措施均起到一定的抑制炎性反应的作用。

本实验将构建好的含人类TNF-α基因启动子的质粒DNA，经Lipofectamine2000转染体外培养的VSMCs中，由于luciferrase检测系统的灵敏度较高且其表达比较稳定，弥补了转染效率相对较低的不足，因此可作为研究各种信号调控TNF-α基因转录的良好平台。本研究证实，在VSMCs中，体外转染的TNF-α启动子可高效稳定的表达；而经AngⅡ刺激的VSMCs中，TNF-α启动子活性呈明显上调（P<0.05），直接证明了两者参与炎性反应的可能机制以及对TNF-α基因转录的调节。

阿托伐他汀作为冠心病治疗中的调脂药物，其抗炎作用已在相关文献中报道[9-10]。本研究表明，阿托伐他汀对VSMCs体外转染的TNF-α启动子活性产生明确的抑制作用，并且呈现剂量依赖关系（P<0.05）。从转录水平证明了其抗炎作用。然而，阿托伐他汀发挥其抑制TNF-α启动子的转录活性的细胞信号转导途径，这种抑制作用是否针对TNF-α是特异性的尚不十分明确，仍需进一步研究。

参考文献

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