miR-486-5p通过抑制端粒酶活性促进人骨髓间充质干细胞衰老*

黎 佼， 张竞之， 刘宁宁， 曾波航， 董 珺 △， 刘世明

(1广州医科大学附属第二医院， 2广州心血管疾病研究所，广东 广州 510260)



miR-486-5p通过抑制端粒酶活性促进人骨髓间充质干细胞衰老*

黎 佼1, 2， 张竞之1， 刘宁宁2， 曾波航1， 董 珺1, 2△， 刘世明1, 2

(1广州医科大学附属第二医院，2广州心血管疾病研究所，广东 广州 510260)

目的： 研究年龄相关microRNA-486-5p (miR-486-5p) 对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)衰老的调控作用。方法: 通过microRNA芯片和real-time PCR检测供体年龄对hMSCs 中miR-486-5p表达的影响；通过转染miR-486-5p模拟物或抑制物，过表达miR-486-5p或抑制其表达；用β-半乳糖苷酶染色检测miR-486-5p对hMSCs衰老的影响；通过siRNA研究沉默信息调节因子1(SIRT1)对hMSCs端粒酶逆转录酶(TERT)、端粒酶活性及衰老的影响。结果: 随供体年龄增加，hMSCs 中miR-486-5p的表达增加。过表达miR-486-5p可促进hMSCs衰老。相反，抑制miR-486-5p的表达可减少hMSCs的衰老。SIRT1及TERT随供体年龄增加而表达下降，直接抑制SIRT1的表达可减少TERT表达，抑制端粒酶活性，促进细胞衰老。同时抑制miR-486-5p和SIRT1的表达，使miR-486-5p失去对hMSCs端粒酶活性及衰老的调控作用。结论: miR-486-5p通过抑制SIRT1，减少hMSCs端粒酶活性，促进hMSCs衰老。

人骨髓间充质干细胞； MicroRNA-486-5p； 衰老

在前期研究中我们发现，人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells, hMSCs)中部分microRNA的表达随供体年龄的增加而发生改变[1]。并且，这些年龄相关microRNA参与hMSCs多种功能的调控。例如随年龄增加，miR-10a表达下调，并可通过抑制转录因子Klf4促进hMSCs分化[1]。而随年龄增加，表达上调的miR-196a，可通过抑制同源框B7(homeobox B7，HOXB7)减少hMSCs增殖[2]。最近的研究发现，miR-486-5p在人脂肪组织来源的间充质干细胞(human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，hAT-MSCs)复制性衰老过程中，可促进细胞衰老，但其分子机制尚不明确[3]。而我们的研究发现，miR-486-5p在hMSCs供体年龄增加、细胞自然衰老过程中表达增加。基于miR-486-5p可能促进细胞衰老，本研究进一步探讨了miR-486-5p调控hMSCs衰老的分子机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 人骨髓的提取 通过广州医科大学附属第二医院伦理委员会批准，与患者签订知情同意书后，在心脏瓣膜病患者手术过程中吸取人骨髓5 mL。17～30岁志愿者定义为年青(young，Y)组，65～80岁志愿者定义为年老(old，O)组，排除肿瘤、乙肝、HIV感染等因素。

1.2 主要试剂及仪器 胎牛血清和Opti-MEM 培养基(Gibco)；Lipofectamine 3000 转染试剂和Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Invitrogen)； SYBR Green荧光定量试剂盒和RNA逆转录试剂盒(Toyobo)；淋巴细胞分离液(MPBIO)；端粒酶活性检测试剂盒(南京凯基公司)；β-半乳糖苷酶染色试剂盒(CST)；荧光定量PCR仪(ABI)。

2 方法

2.1 hMSCs的提取及鉴定 将人骨髓小心叠加于等体积的淋巴细胞分离液上层，2 000 r/min离心20 min，吸取分离液和血浆界面的云雾状的单个核细胞层，用无血清IMDM悬浮后，以1 000 r/min离心。按2×109/m2密度接种于培养瓶中培养。48 h后换液，贴壁细胞每3 d换液，待细胞融合度达80%以上时，胰酶消化传代，第3代细胞用于实验研究并通过流式细胞仪检测细胞表面特异性抗原表达(CD29、CD31、CD34、CD44、CD45和CD166)[1]。

2.2 MicroRNA基因芯片检测及real-time PCR检测 分别选取年青组(17、20、25岁)及年老组(78、80、75岁)hMSCs送于北京博奥生物有限公司进行microRNA基因芯片检测。用1 μg总RNA逆转录为cDNA。通过real-time PCR检测miR-486-5p和沉默信息调节因子1(silence information regulator 1， SIRT1) mRNA的表达。分别选取U6及GAPDH作为内参照。各基因引物序列见表1。

表1 引物序列

2.3 细胞转染 miR-486-5p模拟物、抑制物和si-SIRT1及其相应的阴性对照均由上海吉玛公司合成，具体序列见表2。其中转染miR-486-5p阴性对照组定义为对照组1(control 1,C1)；转染si-SIRT1阴性对照组定义为对照组2(control 2，C2);同时转染miR-486-5p抑制物阴性对照及si-SIRT1阴性对照组定义为对照组3(control 3，C3)。hMSCs培养于 24 孔板，无血清培养过夜后，更换为新鲜无血清及抗生素培养基(500 μL/孔)。将小分子 RNA 稀释于100 μL Opti-MEM培养基中，加入1 μL Lipofectamine RNAiMAX，轻柔混匀后室温放置15 min；将 RNAiMAX与miRNA/siRNA的稀释液加入 24 孔板的各孔细胞中，培养48 h按实验需要处理细胞。

表2 MicroRNA与siRNA序列

2.4 β-半乳糖苷酶染色鉴定 通过β-半乳糖苷酶染色试剂盒，检测不同预处理组中细胞衰老情况。hMSCs以3×108/m2密度培养，每孔加入500 μL 染色固定液，室温固定10 min。PBS洗涤后，加入500 μL染色工作液，37 ℃孵育过夜。光学显微镜下观察染色阳性细胞(每实验组做3复孔，每孔随机选取6个区域，ImageJ 软件分析染色阳性细胞)。

2.5 端粒酶活性检测 通过端粒酶检测试剂盒，检测不同预处理组中端粒酶活性。

2.6 Western blotting检测蛋白表达 各实验组细胞处理完毕后，加入细胞裂解液，4 ℃裂解30 min后收取蛋白液，采用BCA法进行蛋白定量。总蛋白经SDS-PAGE分离后，转移到NC膜上。用5%BSA封闭1 h，后分别加入SIRT1抗体(1∶200)及TERT抗体(1∶100)，4 ℃过夜，用TBST洗3次，每次10 min。ECL法显色，用凝胶成像系统扫描分析结果。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，应用SPSS 16.0统计软件分析，2组间的差异显著性采用独立样本t检验，多组间的差异显著性采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。 以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 miR-486-5p随供体年龄增加而表达上调

通过Affymetrixr Gene Chip 2.0 miRNA芯片分析，我们发现miR-486-5p随供体年龄的增加而表达上调，见图1A。通过real-time PCR检测，我们进一步证实，年老组hMSCs中miR-486-5p表达量为年青组的1.86倍，见图1B。

2 SIRT1及端粒酶活性随供体年龄增加而表达下调

通过real-time PCR检测，我们发现随供体年龄的增加，SIRT1 mRNA和蛋白表达下调(O组mRNA表达量为Y组的38%)，TERT蛋白表达下调，见图1C、D；端粒酶活性下降，O组为Y组的27%，见图1G；细胞衰老增加，O组β半乳糖苷酶染色阳性率为Y组的2.90倍，见图1E、F。

Figure 1.Changes of miR-486-5p and telomerase activity in aged hMSCs. A: miR-486-5p expression in young (Y) and old (O) hMSCs was determined by microarray analysis； B: miR-486-5p expression in Y and O hMSCs determined by real-time PCR; C: SIRT1 mRNA expression in Y and O hMSCs; D: SIRT1 and TERT protein expression in Y and O hMSCs; E, F: representive images of β-galactosidase staining (arrows indicate positive cells,×200) and quantification of cell senescence; G: telomerase activity in Y and O hMSCs. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs O.

3 miR-486-5p促进hMSCs衰老

转染miR-486-5p模拟物，可在hMSCs中过表达miR-486-5p(为对照组的10.93倍)；相反，转染miR-486-5p抑制物，可抑制miR-486-5p的表达(为对照组的25%)，见图2A。过表达miR-486-5p后，通过β-半乳糖苷酶染色检测，我们发现hMSCs细胞衰老增加(为对照组的2.34倍)；相反，抑制miR-486-5p表达后，hMSCs衰老减少(为对照组的34%)，见图3A、B。

4 miR-486-5p通过抑制SIRT1减少端粒酶活性

通过real-time PCR检测，我们发现，通过转染miR-486-5p模拟物在hMSCs中过表达miR-486-5p时，SIRT1表达下调(为对照组的29%)，TERT蛋白表达下调，端粒酶活性下降(为对照组的57%)，而在hMSCs中抑制miR-486-5p表达时，SIRT1表达升高(为对照组的4.43倍)，TERT蛋白表达增加，端粒酶活性上升(为对照组的3.15倍)，通过si-SIRT1，我们可在hMSCs中直接抑制SIRT1 mRNA及蛋白的表达(mRNA为对照组的13%)，直接抑制SIRT1的表达后，hMSCs 中TERT蛋白表达下调，端粒酶活性下降(为对照组的46%)，衰老增加(β半乳糖苷酶染色检测，为对照组的2.29倍)。而在hMSCs中同时抑制miR-486-5p及SIRT1表达后，使抑制miR-486-5p所引起的端粒酶活性上升、细胞衰老减少的作用消失，见图2、3。

Figure 2.Effects of miR-486-5p and SIRT1 on hMSC senescence. A: up-regulated miR-486-5p expression in hMSCs by miR-486-5p mimic (M) and down-regulated miR-486-5p expression in hMSCs by miR-486-5p inhibitor (I)； B: the mRNA expression of SIRT1 in hMSCs transfected respectively by miR-486-5p mimic, miR-486-5p inhibitor, si-SIRT1 (s), or miR-486-5p inhibitor and si-SIRT1 (I+s)； C: the protein expression of SIRT1 and TERT in hMSCs transfected respectively by miR-486-5p mimic, miR-486-5p inhibitor, or si-SIRT1; D: telomerase activity in hMSCs transfected respectively by miR-486-5p mimic, miR-486-5p inhibitor, si-SIRT1, or miR-486-5p inhibitor and si-SIRT1. C1～3: controls. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs C1; ▲P<0.05 vs C2.

Figure 3.β-galactosidase staining for detecting effects of miR-486-5p and SIRT1 on hMSC senescence. A: representive images of β-galactosidase staining (arrows indicate positive cells，×200) in hMSCs transfected by miR-486-5p mimic (M), miR-486-5p inhibitor (I), si-SIRT1 (s), or miR-486-5p inhibitor and si-SIRT1 (I+s)； B: quantitative analysis of β-galactosidase staining positive cells. C1～3: controls. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs C1; ▲P<0.05 vs C2.

讨 论

本课题组前期研究证实，供体年龄影响了MSCs的增殖能力、分化能力及细胞的衰老[4]；随供体年龄差异表达的microRNA，参与调控年龄因素引起的hMSCs功能改变[1]。本研究承前启后，进一步探讨了随供体年龄差异表达microRNA——miR-486-5p对hMSCs衰老的调控作用及其机制。我们发现miR-486-5p可通过抑制SIRT1减少hMSCs端粒酶活性，促进hMSCs衰老。

研究证实miR-486-5p参与细胞增殖、迁移、凋亡、衰老和分化等过程的调控。例如：在非小细胞肺癌的研究中发现，与正常组织相比肿瘤组织中miR-486-5p的表达明显下降。而过表达miR-486-5p可通过抑制ARHGAP5，导致细胞增殖能力下降，从而抑制肺癌细胞迁移、侵袭和肺癌体内转移[5]。而在人成纤维细胞系(IMR90)复制性衰老中的研究发现，miR-486-5p可通过促进DNA双链断裂以及增加氧自由基聚集，抑制细胞增殖，促进细胞衰老[6]。在hAT-MSCs复制性衰老的研究中同样发现，miR-486-5p可促进细胞衰老，抑制细胞增殖并抑制其向脂肪细胞、成骨细胞分化[3]。与此结果类似，我们的研究发现miR-486-5p的表达随hMSCs供体年龄的增加而上调，miR-486-5p可通过抑制细胞端粒酶活性，促进hMSCs衰老。

Kim 等[3]在hAT-MSCs的研究中，证实SIRT1为miR-486-5p的靶基因，miR-486-5p通过抑制其表达发挥细胞调控作用。而在前期研究中发现，SIRT1参与多种细胞功能的调控，在机体生命周期调控中起重要作用。例如在对P53、FOXOs、E2F1、Ku70去乙酰化，应激反应，DNA修复，细胞凋亡、衰老，基因组稳定性等机制研究中，均已证实SIRT1的调控作用[7-8]。在肝癌中的研究更是进一步发现，SIRT1在维持端粒稳定性中起重要作用。在肝癌细胞中抑制SIRT1的表达，可抑制端粒酶反转录酶及PTOP的表达，引起端粒功能下降，诱导细胞衰老或者凋亡，最终导致细胞增殖下降[9]。Yamashita等[9]在人脐带成纤维细胞中的研究发现，SIRT1可通过促进TERT核心启动子中c-myc的表达，激活c-myc转录，促进端粒酶逆转录酶转录，减少细胞衰老。同样，我们的研究证实，SIRT1随供体年龄的增加而表达下调。进一步的功能实验证实，SIRT1表达下降引起的端粒酶活性下降是促进hMSCs衰老的主要因素。

我们的研究证实miR-486-5p随hMSCs供体年龄的增加而表达上调，从而抑制了其靶基因SIRT1的表达，导致hMSCs端粒酶活性下降，衰老增加。本课题阐述了miR-486-5p调控hMSCs衰老的机制，为年龄相关microRNAs及hMSCs的运用提供了理论基础及新的研究方向。

[1] Li J, Dong J, Zhang ZH, et al. miR-10a restores human mesenchymal stem cell differentiation by repressing KLF4[J]. J Cell Physiol, 2013, 228(12):2324-2336.

[2] 黎 佼，董 珺，张振辉，等. MicroRNA-196a通过HOXB7调控人骨髓间充质干细胞增殖功能[J]. 中国病理生理杂志, 2014, 30(2):278-285.

[3] Kim YJ, Hwang SH, Lee SY, et al. miR-486-5p induces replicative senescence of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and its expression is controlled by high glucose[J]. Stem Cells Dev, 2012, 21(10):1749-1760.

[4] 黎 佼，陈敏生，杨伟健，等. 年轻骨髓间充质干细胞可通过细胞融合改善年老骨髓间充质干细胞功能[J]. 中国病理生理杂志, 2010, 26(5):976-981.

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miR-486-5p enhances senescence of human mesenchymal stem cells by decreasing telomerase activity

LI Jiao1, 2, ZHANG Jing-zhi1, LIU Ning-ning2, ZENG Bo-hang1, DONG Jun1, 2, LIU Shi-ming1, 2

(1TheSecondAffiliatedHospital,GuangzhouMedicalUniversity,2GuangzhouInstituteofCardiovascularDisease,Guangzhou510260,China.E-mail:dj330@139.com)

AIM: To investigate the effects of microRNA-486-5p (miR-486-5p) on the senescence of human mesenchymal stem cells (hMSCs). METHODS: The expression of miR-486-5p was determined by miRNA arrays and real-time PCR. By transfection of miR-486-5p mimic or inhibitor, up-regulation or down-regulation of miR-486-5p expression in hMSCs was established. The effect of miR-486-5p and silence information regulator 1 (SIRT1) on hMSC telomerase activity and senescence were detected by β-galactosidase staining. RESULTS: The expression of miR-486-5p was up-regulated in the old hMSCs compared with the young hMSCs. Up-regulation of miR-486-5p resulted in increasing senescence of hMSCs. Conversely, down-regulation of miR-486-5p resulted in decreasing cell senescence. The expression of SIRT1 and telomerase reverse transcriptase (TERT) was down-regulated in the old hMSCs compared with the young hMSCs. Directly repression of SIRT1 expression inhibited the hMSC TERT protein expression and telomerase activity, but increased cell senescence. The regulation of miR-486-5p on hMSC senescence was attenuated by inhibiting the expression of miR-486-5p and SIRT1 together. CONCLUSION: miR-486-5p enhances senescence of hMSCs by decreasing the expression of SIRT1 and telomerase activity.

Human mesenchymal stem cells; MicroRNA-486-5p; Senescence

1000- 4718(2015)03- 0547- 05

2014- 09- 23

2014- 11- 09

国家自然科学基金青年科学基金资助项目(No. 81401156)； 广州市医药卫生科技项目(No. 20141A011088)； 广州医科大学博士科研项目(No. 2013C49)

△通讯作者 Tel: 020-34153522; E-mail: dj330@139.com

R363； R339.3+8

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.029