刺五加苷B/E对高糖环境下HBZY-1细胞增殖及TGF-β1和PPARγ表达的影响*

吴建华， 杜银香， 黄 强△

(湖北民族学院 1附属民大医院泌尿外科, 2医学院， 湖北 恩施 445000)



刺五加苷B/E对高糖环境下HBZY-1细胞增殖及TGF-β1和PPARγ表达的影响*

吴建华1， 杜银香2， 黄 强1△

(湖北民族学院1附属民大医院泌尿外科,2医学院， 湖北 恩施 445000)

目的： 探讨刺五加苷B/E(ETS-B/E)对高糖环境大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1增殖的影响及机制。方法: 进行HBZY-1细胞传代、无菌培养，选生长良好的第4代HBZY-1细胞，测定高糖(25 mmol/L)环境下符合生长规律曲线图的细胞密度。然后接种6组，分成低糖组(LG)、高糖组(HG)、高糖ETS-B/E(低剂量、中剂量、高剂量)组和高糖洛沙坦组(LTG)。予以相应药物干预后，测定在24 h、48 h和72 h时，其对HBZY-1细胞生长的抑制作用和抑制率，并用免疫细胞化学和Western blotting检测各组增殖过程中TGF-β1和PPARγ的表达情况。结果: HBZY-1细胞的接种浓度为每孔2 000个时，符合细胞生长基本规律，高糖显著促进HBZY-1细胞的增殖。ETS-B/E作用下，在各时点，对HBZY-1细胞的抑制作用和抑制率与HG有显著差异(P<0.05)；免疫细胞化学和Western blotting分析均显示，ETS-B/E能显著抑制TGF-β1表达和促进PPARγ表达(P<0.05)，且ETS-E显著强于ETS-B(P<0.05)，呈浓度和时间依赖性趋势。结论: ETS-B/E对高糖环境下HBZY-1细胞的增殖具有显著抑制作用，其作用机制与阻止TGF-β1的表达和促进PPARγ的表达相关。

刺五加苷B/E； 肾小球系膜细胞； 转化生长因子β1； 过氧化物酶体增殖物激活受体γ

慢性肾功能衰竭(chronic renal failure，CRF)已成为直接影响人类生活质量和危害人类健康的主要疾病之一。有研究证实，非诺贝特联合刺五加注射液治疗糖尿病性CRF，患者随着血清肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)的减少而逐渐呈现明显肾功能改善趋势[1]。另有研究证实，刺五加提取物能直接抑制肾小球入球和出球小动脉的收缩，改善肾脏微循环，阻止或逆转肾小球血管重构，减少肾小球血管胶原纤维沉积，增加肾小球血管弹力层，从而抑制入球小动脉玻璃样变，阻止肾小球纤维化[2]。这种机制与增强肾小球的组织型纤溶酶原激活剂活性，抑制肾小球的纤溶酶原激活物抑制物1活性，降低血内皮素含量和血液黏滞度相关[3]。临床观察发现，随着糖尿病发病率的逐年增加，其已成为CRF的主要原因之一。现已证实，CRF与高血糖状态密切相关外，还与多种细胞因子的分泌紊乱密切相关[1]。临床实践证明，一旦发生CRF，目前没有有效的逆转措施，只是通过血液透析或肾移植手术维持生命[2]。因此，有效的药物预防是阻止糖尿病性CRF的主要手段。本文报道刺五加苷B/E(eleutheroside B/E，ETS-B/E)能显著抑制肾小球系膜细胞HBZY-1的增殖，这可能与临床资料显示其防治CRF相关[4]。

材 料 和 方 法

1 细胞、实验材料与仪器

大鼠肾小球系膜细胞HBZY-1(上海通派生物科技有限公司)；高糖(high glucose， LG)和低糖(low glucose， LG)DMEM培养基、双抗溶液(Gibco)；澳大利亚优质胎牛血清(北京博益伟业仪器有限公司)；一次性塑料培养瓶(Costar)；噻唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)(上海谱振生物科技有限公司)；含EDTA胰酶溶液(广州伟伯化工有限公司)；刺五加苷B/E(成都普瑞法科技开发有限公司)；氯沙坦钾片(losartan，LT)(杭州默沙东制药有限公司)；兔抗大鼠TGFβ1多克隆抗体、SABC-F兔抗大鼠IgG免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒及兔抗大鼠过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor, PPARγ)(武汉博士德生物工程有限公司)；羊抗兔 II 抗，羊抗大鼠 II 抗(Proteintechm)；Trizol试剂(Dako)；超灵敏ECL发光试剂盒(北京优剂生物科技有限公司)；BD Falcon U型不同孔数细胞培养板(Millipore)。

BB16UV和BB5060UV型恒温CO2培养箱(Heraeus)；DZF-6210实验室真空干燥箱、KH-700DE型数控超声波清洗器(Millipore)；SW-CJ-1CU超净工作台(上海巴玖实业有限公司)；XL90型超速低温离心机(北京北加美因生物技术有限公司)；TG1850-WS高速冰冻离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；梅特勒ML104电子天平(Precisa)；CKX41倒置显微镜(Olympus)；显微图像分析系统(日本平泽制作所)；PCR 仪、电泳仪及电泳槽(Bio-Rad)；恒温振荡器和恒温摇床(Eppendorf)。

2 主要药物的配制

称取氯沙坦钾片 46 mg，加入DMSO 1 mL充分溶解，于-20 ℃保存备用，使用时以高糖完全培养基稀释成相应浓度。分别称取ETS-B和ETS-E各44.6 mg，加入DMSO 1 mL充分溶解，于-20 ℃保存备用，使用时以高糖完全培养基稀释成相应浓度。

3 实验方法

3.1 HBZY-1培养与鉴定 37 ℃水浴箱轻摇振荡复苏HBZY-1，吸取细胞悬液移入离心管，加入3～4 mL 10%胎牛血清细胞培养液，混匀离心5 min(1 000 r/min)，弃上清；再加入适量细胞培养液，移入细胞培养瓶，37 ℃、5% CO2培养24 h；至80%细胞融合时进行细胞传代，吸去培养液，用PBS液冲洗3次，加入0.8 mL 0.25%胰蛋白酶消化2～3 min(镜下观察细胞形态变为圆球形、间隙增大、胞质回缩)，加入胎牛血清培养液终止消化；吸去培养液，轻吹制成细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃上清，再加入培养液继续培养，传代至第5代。

于倒置显微镜下观察，生长活跃的HBZY-1细胞呈贴壁生长，体积较大，形状为梭形、不规则星形、三角形或树枝形，细胞质向外伸出多个大小不等的突起，中央的卵圆形核清晰可见。

3.2 实验分组 选生长良好(镜下生长均匀、外形紧凑、透光性好、折光性强、轮廓清、胞浆体积小、胞浆颗粒状少)的第4代HBZY-1细胞，接种于6孔板，加盖玻片，设置2个对照孔后分成低糖组(LG，5.5 mmol/L)、高糖组(HG，25 mmol/L)、ETS-B/E低剂量组(ETS-B/E-L，HG 25 mmol/L+ETS-B/E 25 μmol/L)、ETS-B/E中剂量组(ETS-B/E-M，HG 25 mmol/L+ETS-B/E 50 μmol/L)、ETS-B/E高剂量组(ETS-B/E-H，HG 25 mmol/L+ETS-B/E 100 μmol/L)和LT阳性对照组(LTG，HG 25 mmol/L+LT 10 μmol/L)。

3.3 HBZY-1生长曲线的测定 待各组HBZY-1细胞达80%融合时，经胰酶常规消化制成细胞混悬液。以含10% 胎牛血清的低糖完全培养液将细胞浓度调整为2、5、10×107/L共3个浓度，并进行细胞计数。于96孔板各孔中加入100 μL细胞混悬液(终浓度每孔为2 000、5 000和10 000个)，各浓度设置18个复孔，边缘以PBS封闭。通以5% CO2、37 ℃分别恒温培养24 h、48 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h(培养较久的中途换液)后，各自加入20 μL MTT，通5% CO2、37 ℃恒温孵育4 h，去MTT液，各孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，以酶标仪观察记录吸光度A值(波长492 nm，A1孔作为调零孔)，绘出HBZY-1细胞的生长曲线，得出168 h内的最佳接种浓度。据GMC生长曲线进行细胞增殖实验检测。待细胞生长达80%融合时经胰酶消化处理成细胞混悬液。以含10%胎牛血清的低糖培养液调整浓度为2×107/L，进行细胞计数后，96孔板中每孔(设6个复孔)加入细胞混悬液100 μL，周边以PBS封闭，通5% CO2、37 ℃恒温孵育24 h。细胞贴壁24 h后去上清，分别于24 h、48 h、72 h加入100 μL无血清DMEM/F12培养液各自培养24 h，细胞同步于G0期后，去上清，按分组予以刺激。

×100%， 抑制率(%)=100%-存活率。

3.4 免疫细胞化学法检测TGF-β1和PPARγ的表达 经胰酶常规消化制成的各组细胞混悬液，于6孔板中用一次性塑料吸管吸取PBS轻洗3次，风干，用4%多聚甲醛室温固定30 min，蒸馏水轻洗3次。室温浸泡固定玻片20 min(固定液用30% H2O2与纯甲醇按1∶ 50配比)，滴加5% BSA封闭液孵育20 min，再分别滴加相应的 I 抗兔IgG稀释液后，于4 ℃冰箱放置24 h，以PBS轻洗3次，分别滴加相应的生物素化兔抗大鼠IgG，恒温37 ℃孵育20 min，PBS轻洗3次。再滴加SABC，恒温37 ℃孵育20 min，PBS轻洗4次，以DAB显色试剂盒对处理的各组玻片予以室温显色20 min(镜下控制反应时间)，蒸馏水洗涤。甩干玻片，苏木素复染，分别以不同浓度二甲苯和乙醇脱水，透明化处理后树胶封片，镜下观察。

3.5 图像分析 置DAB显色玻片于光学显微镜下，将图像经物镜输入摄像机，以图像分析系统定量分析各组的表达情况。选择14个视野测定吸光度，同一光强度下测定每张玻片均值。用SPSS 11.0软件行配对t检验，比较各组平均积分吸光度(integral absorbance，IA)。

3.6 Western blotting法检测TGF-β1和PPARγ的蛋白表达 细胞培养于葡萄糖或药物刺激结束后，弃培养基，PBS洗涤，加入100 μL RIPA裂解细胞30 min、将裂解液4 ℃、14 000 r/min离心20 min，取上清与等量待测样品混合，100 ℃加热5 min，以12% SDS-PAGE后转移到PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭1 h，用1×TBST洗涤3次，加入 I 抗4 ℃孵育24 h，再以1×TBST洗涤3次，加入 II抗孵育1 h，1×TBST洗涤3次，用BCA法进行蛋白定量。

4 统计学处理

相同条件下每组实验重复6次，所有数据用SPSS 11.0软件处理。计量数据用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较使用 Dunnett-t检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 HBZY-1细胞正常生长曲线的测定

结果显示，HBZY-1细胞接种浓度为10 000 cells/well时，24 h～48 h为倍增期，48 h～72 h为平台期，72 h之后进入衰亡期；HBZY-1细胞接种浓度为5 000 cells/well时，24 h～48 h为倍增期，随之进入缓慢增殖期，至96 h达增殖高峰后迅速进入衰亡期；HBZY-1细胞接种浓度为2 000 cells/well时，24 h～48 h为潜伏期(缓慢增殖期)，48 h～72 h为倍增期，72 h～120 h达平台期，120 h后进入衰亡期。由生长曲线图发现，HBZY-1接种浓度为2 000 cells/well时，其生长曲线图接近“S”形，符合细胞生长的基本规律，见图1。

Figure 1.The growth curves of the HBZY-1 cells cultured with different cell densities determined by MTT assay. Mean±SD. n=6.

2 ETS-B/E对高糖浓度环境下HBZY-1细胞生长的抑制作用

结果显示，各组A值随时间延长显著增高，且各个时点的A值HG组均高于LG组(P<0.05)；24 h时，LTG组与HG组无显著差异(P>0.05)，其余各组与HG组具有显著差异(P<0.05)；在同一时点，ETS-B-M组和ETS-B-H组的A值分别显著低于ETS-E-M组和ETS-E-H组(P<0.05)，ETS-B-H组和ETS-E-H组的A值显著低于LTG组(P<0.05)；ETS-B/E各不同剂量组的抑制率显著大于LTG组，而ETS-E又显著大于ETS-B(P<0.05)，见表1、图2。

表1 ETS-B/E对HBZY-1细胞生长的影响

*P<0.05vsLG at the same time point;△P<0.05vsHG at the same time point;▲P<0.05vsETS-B/E-L at the same time point;#P<0.05vsthe same concentration of EST-B at the same time point.

Figure 2.The effects of ETS-B/E on the inhibitory rate of HBZY-1 cells cultured with high glucose at different time points. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs ETS-B-H; #P<0.05 vs ETS-B-M and ETS-B-L at the same time point; ▲P<0.05 vs ETS-B/E at the same time poimt.

3 免疫细胞化学法检测EST-B/E对TGF-β1和PPARγ表达的影响

免疫细胞化学法检测结果显示，不同浓度ETS作用下TGF-β1 的平均吸光度显著低于HG组(P<0.05)，而且随着浓度梯度的增加而显著降低，呈现明显的浓度依赖趋势。结果还发现，在同一浓度状态下，ETS-E显著低于ETS-B (P<0.05)，并呈现浓度依赖趋势；在同一浓度状态下，ETS-E显著高于ETS-B (P<0.05)，不同浓度ETS-B/E作用下，TGF-β1的表达与剂量呈现明显的负相关趋势(P<0.05)。而在不同浓度ETS-B/E作用下，PPARγ的表达与剂量呈现明显的正相关趋势(P<0.05)，见图3、4和表2、3。

4 Western blotting法检测EST-B/E对TGF-β1和PPARγ蛋白表达的影响

TGF-β1蛋白电泳条带胶片感光定性分析显示，ETS-B/E组显著弱于HG组，且随浓度的增加而逐渐减弱；而检测PPARγ的Western blotting图显示，ETS-B/E组显著强于HG组，且随浓度的增加而逐渐增强；蛋白电泳条带定量分析显示，HG组的TGF-β1蛋白表达量显著高于各个浓度的ETS-B/E组，且随ETS-B/E浓度的增加，其表达量逐渐降低(P<0.05)；而HG组的PPARγ蛋白表达量显著低于各个浓度的ETS-B/E组，且随其浓度的增加，其表达量逐渐升高(P<0.05)，且同一浓度的ETS-E显著强于ETS-B(P<0.05)。表明ETS-B/E能显著抑制TGF-β1蛋白表达而促进PPARγ蛋白表达，见图5。

Figure 3.The effects of ETS-B/E at different concentrations on the expression of TGF-β1 and PPAR-γ in the HBZY-1 cells cultured with high glucose determined by immunocytochemical method. Mean±SD. n=6.

讨 论

高糖是引起肾小球肥大，导致糖尿病肾病的始动因素，也是导致慢性肾衰竭的重要原因[3]。HBZY-1 细胞是肾小球内非常活跃的细胞，主要生理功能是吞噬和处理肾小球滤过膜的免疫复合物和大分子蛋白质，维持滤过膜的通透性，发挥着单核-巨噬细胞样功能；合成与分泌细胞外基质，维系肾小球毛细血管网结构的完整性；收縮或舒张肾小球血管，调节肾小球血流量和滤过率；分泌多种细胞因子或生长因子(TGF-β1、PDGF、TNF-α及renin等)，维持肾脏功能[5]。其病变与肾功能损伤、衰竭密切相关，肾小球系膜细胞的过度增生是肾病引起肾小球肥大、细胞外基质增多和肾小球硬化的最突出的病理变化[6]。

本研究显示，在高糖环境下，HBZY-1细胞接种浓度为2 000 cells/well 时，其生长曲线图接近“S”形，能较准确反映出 HBZY-1 细胞生长的基本规律，表明高糖环境下能促进肾小球系膜细胞从静止型细胞转化为分泌或增殖型细胞[7]。因此，在此条件下，可以作为细胞生物学特性的基本参数，能客观地反映ETS-B/E干预的时间、条件及有效性。由于高糖可对肾小球系膜细胞增殖的调节具有双向性(早期促进细胞增殖，72 h后抑制细胞增殖)[6-7]。故此，本实验检测HBZY-1细胞不同时点的A值只截止至72 h。

Figure 4.The effects of ETS-B/E at concentration of 100 μmol/L on the expression of TGF-β1 and PPARγ in the HBZY-1 cells cultured with high glucose determined by immunocytochemical method.

实验证实，ETS-B/E对高糖环境下HBZY-1细胞的生长和增殖率均有显著的抑制作用，高剂量ETS-B/E的A值显著低于洛沙坦，但不同剂量组的抑制率显著大于洛沙坦，且这种抑制作用呈现明显的剂量和浓度依赖性，其中ETS-E显著强于ETS-B。表明ETS-B/E对高糖环境下HBZY-1细胞的生长和增殖呈现剂量和浓度依赖性抑制作用，但这种抑制作用弱于洛沙坦，其中ETS-E强于ETS-B。有报道证实，ETS-B/E作用靶点就是肾小球系膜细胞，能直接扩张肾脏血管，改善肾脏微循环，减轻肾脏慢性缺血[8]；另有报道，刺五加醇提取物能减少肾小球胶原纤维沉积和弹力层断裂，减轻肾血管增生，阻止肾小球血管发生玻璃样变，避免肾小球纤维化形成[9]。这些效应与本实验结果相一致，结合本研究内容分析，其作用机制可能如下。

表2 免疫细胞化学法检测不同浓度ETS-B/E对TGF-β1表达的影响

*P<0.05vsHG;△P<0.05vs100 μmol/L of the same group;▲P<0.05vsthe same concentration of ETS-B.

表3 免疫细胞化学法检测不同浓度ETS-B/E对PPARγ表达的影响

*P<0.05vsHG;△P<0.05vs100 μmol/L of the same group;▲P<0.05vsthe same concentration of ETS-B.

Figure 5.The effects of ETS-B/E at different concentrations on the protein levels of TGF-β1 and PPAR-γ in the HBZY-1 cells cultured with high glucose determined by Western blotting. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs HG; #P<0.05 vs ETS-B.

免疫细胞化学法检测结果显示，不同浓度ETS-B/E作用下，TGF-β1的表达与剂量呈现明显的负相关趋势。Western blotting检测结果显示，TGF-β1蛋白电泳条带胶片感光定性和定量分析均呈现，高糖时TGF-β1蛋白表达显著增强，而ETS-B/E作用后，TGF-β1蛋白表达显著减弱，并显示为浓度依赖性。这些均表明ETS-B/E抑制高糖环境下HBZY-1细胞生长和增殖与抑制TGF-β1蛋白表达有关。有研究发现，高糖和TGF-β1的作用能导致HBZY-1肥大和外基质合成增多而蓄积，最终导致肾小球硬化。虽其信号通路机制目前尚未完全清楚，但已经清楚增殖性肾小球疾病中，与HBZY-1细胞从静止型细胞转化为分泌或增殖型细胞的表型转化密切相关[5]。而组织学研究证明，HBZY-1细胞与血管平滑肌细胞为同源细胞，在胚胎时期，HBZY-1细胞活跃增殖，合成细胞外基质，并产生多种重要细胞因子，促进肾小球的形成，体内成熟的HBZY-1细胞更替缓慢，称为静止型HBZY-1。若在高糖或TGF-β1的刺激下，可从静止型转化为分泌或增殖型，从而重新表达血管平滑肌肌动蛋白，进行肾小球的自我修复，若过度表达就可能使肾小球细胞外基质蓄积，最终造成肾小球硬化而诱发肾病[4, 6]。这表明ETS-B/E抑制高糖环境下HBZY-1细胞生长和增殖与阻止TGF-β1蛋白表达密切相关。

免疫细胞化学法检测结果显示，不同浓度ETS-B/E作用下，PPARγ的光密度表达与剂量呈现明显的正相关趋势；Western blotting检测结果显示，PPARγ蛋白电泳条带胶片感光定性和定量分析均呈现高糖时PPARγ蛋白表达显著减弱，而ETS-B/E作用后，PPARγ蛋白表达显著增强，并显示为浓度依赖性。这些均表明ETS-B/E阻止高糖环境下HBZY-1细胞生长和增殖与促进PPARγ蛋白表达有关。有研究表明，PPARγ系核激素受体超家族成员的一个亚型，是调节脂肪细胞分化和能量代谢的关键性转录因子[9]。HBZY-1细胞与血管平滑肌细胞都起源于间叶组织，生物学特征相似。肾病的基本病理变化是细胞外基质增多，导致肾小球毛细血管腔狭窄或闭塞，其病理与血管平滑肌细胞介导的动脉粥样硬化相似[1]。有研究证实，PPARγ具有抑制HBZY-1细胞的增殖作用，其信号途径是延长HBZY-1细胞周期中G1期到S期进程，或使周期素依赖性蛋白激酶抑制因子P27下调和P21上调[1, 4]；PPARγ配体通过抑制DAG-PKC-ERK信号途径和AP-1的活化而抑制TGF-β1的表达，从而发挥阻止细胞外基质积聚、肾小球纤维化的作用[10]。另有报道，PPARγ拮抗AP-1和NF-κB活性，进而抑制PAI-1转录，阻止HBZY-1细胞基质聚积[9]。亦有研究提示，PPARγ可激活HGF，抑制Smad3核转移而阻止HBZY-1细胞增殖，同时下调TGF-β1和 PAI-1表达，达到延缓肾小球硬化[8]。这些证据直接说明，PPARγ是阻止HBZY-1细胞生长和增殖的重要信号途径，间接表明ETS-B/E阻止HBZY-1细胞生长和增殖与促进PPARγ表达相关。

总之，ETS-B/E能有效阻止HBZY-1生长和增殖，其作用机制与抑制TGF-β1的过度表达，同时促进PPARγ的表达密切相关。ETS为刺五加Acanthopanaxsenticosus(Rupr．et Maxim) Harms根或茎提取物的总苷成分，系刺五加的主要活性成分[10-11]。ETS包括ETS-/B/C/D/E，占干药材的0.6%～1.5%，其中ETS-B/E为主要成分占总苷40%～60%[9, 11]。有可能成为预防或阻止肾病患者肾小球硬化、玻璃样病变、纤维化等病变的有效辅助药物。

[1] 熊 艳．PPARα激动剂非诺贝特抑制高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖及细胞外基质产生的机制探讨[D].武汉：华中科技大学，2011:13-56．

[2] Olukman M, Sezer ED, Ulker S, et al. Fenofibrate treatment enhances antioxidant status and attenuates endothelial dysfunction in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Exp Diabetes Res, 2010, 2010:828531.

[3] Hou XY, Shen YH, Li CB, et al. PPARα agonist fenofibrate protects the kidney from hypertensive injury in spontaneously hypertensive rats via inhibition of oxidative stress and MAPK activity[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 394(3):653-659.

[4] 郑 京，梁文娜，邵 丹．刺五加注射液对慢性肾小球肾炎患者血t-PA、PAI-1 变化的影响[J]. 中国中西医结合肾病杂志, 2007, 8(9):537-539.

[5] 赵 平．黄芩苷下调NF-κB表达抑制高糖环境下肾小球系膜细胞增殖的研究[D].广州：广州中医药大学，2012.

[6] 苏 宁，赵 平，佘燕玲，等．黄芩苷对糖尿病肾病大鼠足细胞损伤的修复作用研究[J]．中医学报，2011，7(26):803-805.

[7] Huang WP, Yin WH, Chen JW, et al. Fenofibrate attenuates endothelial monocyte adhesion in chronic heart failure：aninvitrostudy[J]. Eur J Clin Invest, 2009, 39(9):775-783.

[8] 李 赫，王东亮，赵洪文．罗格列酮通过激活PPARγ改善肺动脉高压大鼠肺动脉内皮依赖性舒张功能[J]. 中国病理生理杂志, 2013, 29(3):549-553.

[9] 杜 娟，徐学明．刺五加注射液对糖尿病肾病慢性肾衰竭患者血清肿瘤坏死因子水平的影响[J]. 中国中西医结合肾病杂志, 2003, 4(1):42-43.

[10]元红花，程 琳，许妍姬. 刺五加皂苷对Aβ25-35诱发PC12细胞毒性及细胞凋亡的保护作用[J]. 中国老年学杂志, 2014, 34(3):1570-1576.

[11]Huang DB, Hu ZH, Yu ZF. Eleutheroside B or E enhances learing and memory in experimentally aged rats[J]. Neural Regen Res, 2013, 8(12):1061-1070.

Effect of eleutheroside B/E on proliferation and expression of PPARγ and TGF-β1 in HBZY-1 cells cultured with high glucose

WU Jian-hua1, DU Yin-xiang2, HUANG Qiang1

(1DepartmentofUrology,AffiliatedHospital，2MedicalSchool，HubeiUniversityforNationalities,Enshi445000,China.E-mail: 1720482539@qq.com)

AIM: To explore the effects and mechanism of eleutheroside (ETS) B or E on the proliferation of HBZY-1 cells treated with high glucose. METHODS: The HBZY-1 cells were cultured under high glucose condition. The 4th generation of HBZY-1 cells was used for determining the optimal cell density, which was consistent with the growth regulation curve of the cells. The cells were divided into 6 groups: low glucose (LG) group, high glucose (HG) group, high glucose plus ETS-B/E (low dose, medium dose and high dose) groups, and high glucose plus losartan (LTG) group. After all cells were treated with the corresponding drugs at 24 h, 48 h and 72 h, the inhibitory rate of the proliferation was measured, and the expression of TGF-β1 and PPARγ was detected by immunocytochemistry and Western blotting. RESULTS: The best cell density was 2 000 cells/well, which was complied with the basic rules of the cell growth, and high glucose significantly promoted the HBZY-1 cell proliferation. At each time point, the inhibitory effects of ETS-B/E were significantly different between HG group and LTG group on the proliferation of the HBZY-1 cells (P<0.05). The expression of TGF-β1 was significantly inhibited, and the expression of PPARγ was significantly promoted by ETS-B/E (P<0.05). ETS-E showed stronger effect than ETS-B (P<0.05) in a concentration- and time-dependent manner. CONCLUSION: ETS-B/E significantly inhibits the proliferation of HBZY-1 cells under high glucose condition by decreasing TGF-β1 expression and promoting PPARγ expression.

Eleutheroside B/E; Mesangial HBZY-1 cells; Transforming growth factor β1; Peroxisome proli-ferator-activated receptor γ

1000- 4718(2015)03- 0511- 07

2014- 06- 09

2014- 12- 30

湖北省教育厅基金资助项目(No. D20111903)

△通讯作者 Tel: 017-88437479； E-mail: 1720482539@qq.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.022