MicroRNA-1284在胃癌中的表达及其作用机制研究*

韦尉元， 曹稳珑， 张笑石， 詹泽栩， 余 晗， 谢玉波， 肖 强△

(广西医科大学第一附属医院 1胃肠腺体外科， 2麻醉科，广西 南宁 530021)



MicroRNA-1284在胃癌中的表达及其作用机制研究*

韦尉元1， 曹稳珑1， 张笑石1， 詹泽栩1， 余 晗1， 谢玉波2， 肖 强1△

(广西医科大学第一附属医院1胃肠腺体外科，2麻醉科，广西 南宁 530021)

目的： 探讨microRNA-1284(miR-1284)与胃癌的相关性及分子机制。方法: Real-time PCR检测63例胃癌患者的胃癌组织和匹配周围正常胃组织中miR-1284的表达水平及分析其与临床病理特征之间的关系。通过慢病毒载体的构建及包装生成上调miR-1284慢病毒载体并转染胃癌SGC-7901细胞，上调miR-1284后采用real-time PCR验证细胞miR-1284表达水平，CCK-8法检测细胞活性，流式细胞术检测细胞周期和凋亡，划痕实验检测细胞迁移能力，生物信息学软件预测miR-1284潜在的靶基因,real-time PCR测定靶基因JAG1表达水平，Western blotting检测JAG1、Notch1和NF-κB的表达水平。结果: 66.67%胃癌患者胃癌组织miR-1284表达明显低于正常胃组织(P<0.05)，miR-1284的表达在不同年龄、性别、TNM分期和淋巴结转移情况患者间的差异无统计学意义(P>0.05)，但在不同组织学分级患者间的差异有统计学意义(P<0.05)。与LV-NC-GFP组和control组比较，LV-miR-1284组的miR-1284表达水平和细胞凋亡显著升高，细胞周期阻滞于G0/G1期， 细胞活性和细胞迁移能力减弱，JAG1、Notch1和NF-κB的表达水平降低，均有显著差异(P<0.05)。结论: miR-1284可能通过调控其靶基因JAG1而发挥抑制胃癌发生发展的作用。

微小RNA-1284； 胃肿瘤； 慢病毒载体； JAG1

胃癌是常见的消化道肿瘤，虽然目前采取了包括手术、化疗、放疗以及其它综合性治疗措施，但胃癌的治疗效果和临床预后仍然不是很理想。现今我们对于胃癌的发病机理尚缺乏全面深入的了解，临床上也缺乏特异性的胃癌肿瘤标记物，已被发现的胃癌的癌基因或抑癌基因的数量也有限。近年来研究发现，microRNA(miRNA)具有高效调控癌基因或抑癌基因的生物学特性，且约有50%人类miRNA基因定位于与肿瘤相关的染色体区域[1]。因此，近年来其与肿瘤的相关性备受关注。大量研究表明，miRNA在不同的肿瘤中显示各自特异的表达谱，与肿瘤的临床病理特征、转移和预后等密切相关[2]。有研究表明，miRNA与胃癌的发生发展具有一定关系[3]。最新的胃癌miRNA表达谱芯片筛选了与胃癌相关的多个miRNA，其中Chen等[4]的研究发现，miR-1284在胃癌淋巴结转移阳性组织比原胃癌组织表达少，提示miR-1284极可能在胃癌中表达异常并发挥调控作用。为了深入研究miR-1284在胃癌发生发展中的作用，本研究通过荧光定量PCR方法检测验证miR-1284在胃癌患者肿瘤组织的表达情况，并分析其与临床病理特征的相关性，明确其在胃癌中的意义；并通过构建目的miR-1284慢病毒载体，转染胃癌细胞，观察和探讨miR-1284在胃癌中的作用及可能作用机制。

材 料 和 方 法

1 主要材料和试剂

兔抗人JAG1、Notch1、NF-κB和GAPDH抗体购自CST，鼠抗兔Ⅱ抗IRDye 800购自Li-Cor，逆转录试剂盒及扩增试剂盒购自TaKaRa。慢病毒颗粒LV-hsa-miR-1284及其阴性对照LV-NC-GFP的构建、包装和鉴定由上海吉凯公司完成。

2 方法

2.1 收集病理标本 选择2013～2014年在本院接受胃癌切除手术的63例胃癌患者，所纳入的患者均签订了知情同意书。胃癌组织以及匹配癌旁正常组织(距离癌组织4 cm)各取直径为0.5 cm的标本。手术切除后，取的新鲜标本立即置于液氮中冷冻保存。所有胃癌标本均经过病理诊断确认。

2.2 荧光定量PCR检测miR-1284在胃癌组织中的表达 采用Trizol 法提取病理标本总RNA并检测RNA的纯度及浓度。逆转录和PCR反应均严格按照TaKaRa公司提供的说明书，以U6作为内参照进行相对定量，每组设3 复孔，在Roche实时定量荧光PCR仪上进行检测。miR-1284的上游引物序列为5’-CGTCTATACAGACCCTGGCTTTTC-3’，下游引物序列为5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；U6的上游引物序列为 5’-TTATGGGTCCTAGCCTGAC-3’，下游引物序列为5’-CACTATTGCGGGTCTGC-3’；采用2-ΔΔCt法计算miR-1284的相对表达量，ΔCt=CtmiR-1284-CtU6，ΔΔCt=ΔCt癌组织-ΔCt癌旁正常组织。

2.3 细胞的培养和转染 含10%胎牛血清1640培养基常规培养SGC-7901细胞(购自中国科学院上海细胞库)，取对数生长期细胞重悬，以3×105cells/well接种于6孔板。待细胞铺满孔50%～60%时，慢病毒颗粒LV-hsa-miR-1284和LV-NC-GFP(每孔6×109TU)转染SGC-7901细胞，分别命名为LV-miR-1284组和LV-NC-GFP组，未转染任何病毒载体的细胞为空白对照组(control)。转染72 h后收集各组的细胞用于后续实验。并采用荧光定量PCR鉴定miR-1284在转染细胞中的表达。

2.4 CCK-8法检测细胞增殖 取上述各组实验对数生长期的细胞用培养基调整细胞浓度至2×107/L。以每孔100 μL接种于96孔板，每组设3个复孔，共铺5个板。置于恒温培养箱中(37 ℃、5% CO2)常规培养。分别于0 h、24 h、48 h、72 h和96 h各检测1块板，检测时每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在孵育箱内继续孵育1 h后，在450 nm波长处测定吸光度(A)。

2.5 流式细胞术检测各组细胞的周期和凋亡 取上述各组实验的细胞，每个样本收集细胞数1×106个，用PBS洗涤细胞2次，每次2 000 r/min离心5 min，弃上清。在每管细胞中加入体积分数为70%预冷乙醇500 μL吹打混匀固定过夜，4 ℃保存，染色前用PBS洗去乙醇固定液2次(2 000 r/min，5 min)，弃上清。在每管加100 μL RNase A，37 ℃水浴30 min。再加入400 μL PI染色混匀，4 ℃避光30 min，上流式细胞仪检测周期。取上述各组实验的细胞，每个样本收集细胞数5×106个，用PBS洗涤细胞2次，每次2 000 r/min离心5 min，弃上清。加100 μL的binding buffer 悬浮细胞，再加入5 μL Annexin V-PE混匀后，再加入5 μL 7-AAD 混匀。室温下避光反应15 min。再加入400 μL的binding buffer，上流式细胞仪检测凋亡。

2.6 划痕实验检测各组细胞迁移能力 取上述各组实验的细胞悬液，以每孔5×104个分别相应地接种到6孔板中的实验组、阴性对照组、空白对照组，每组细胞设3个复孔。37 ℃孵育24 h，用200 μL移液器枪头于培养板底部划“一”字痕，PBS冲洗2遍，彻底洗脱悬浮细胞。培养至0 h、24 h、48 h和72 h 应用相差显微镜拍摄划痕边缘进展情况，应用NIH 图像处理软件分析细胞迁移程度。

2.7 生物信息学软件预测靶基因 利用TargetScan、miRDB和microRNA这3个预测软件网站，综合分析相关因素，筛选出目的miR-1284可能的潜在靶基因，结果均提示miR-1284可以与JAG1 mRNA的3’UTR区相结合，JAG1为可能的靶基因，见图5。

2.8 荧光定量PCR法检测JAG1 mRNA在各组细胞中的表达 方法同步骤2.2，以GAPDH作为内参照，内参照的上游引物序列为 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物序列为5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；JAG1的上游引物序列为 5’-GATTGCTGCCGTTGCAGAAGTA-3’，下游引物序列为5’-AGCAACAGATCCAAGCCACAGTTA-3’；采用2-ΔΔCt法计算比较JAG1在各组细胞的相对表达量。

2.9 Western blotting 检测靶基因及其下游相关基因蛋白在各组细胞中的表达 按照蛋白提取试剂盒说明提取各组细胞的总蛋白，用BCA法测定蛋白含量。取150～250 μg蛋白径10% SDS-PAGE分离，后转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，用 I 抗稀释液分别加入兔抗人JAG1、Notch1、NF-κB和GAPDH抗体，于4 ℃孵育过夜；用TBST洗涤膜5次，再用含羊抗兔 II 抗IRDye 800(1∶10 000)II抗稀释液常温孵育1 h，用TBST洗涤膜5次，应用 Odyssey 3.0仪器(Li-Cor公司)扫膜显影，以GAPDH为内参照。

3 统计学处理

应用SPSS 13.0软件进行统计学分析，计量资料数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析，计数资料采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 miR-1284在胃癌和匹配癌旁正常组织的表达

63例胃癌患者中，21例胃癌患者的胃癌组织miR-1284表达量高于癌旁正常组织，占33.33%；42例胃癌患者的胃癌组织miR-1284表达量低于癌旁正常组织，占66.67%，差异有统计学意义(P<0.05)。

2 miR-1284与胃癌临床病理特征的相关性

miR-1284的表达量与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期和淋巴结转移情况无明显相关，差异无统计学意义(P>0.05)，但miR-1284的表达量与胃癌的组织学分级有关，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 miR-1284与胃癌临床病理特征的相关性

3 荧光定量PCR检测胃癌SGC-7901细胞转染慢病毒干扰载体后miR-1284的表达

转染LV- miR-1284组、LV-NC-GFP组和control组的miR-1284相对表达量用Ct值表示分别为-10.31±0.09、-14.02±1.04和-14.69±1.19，其中Lv-miR-1284组的表达量高于阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；而阴性对照组和空白对照组比较无显著差异(P>0.05)。

4 CCK-8法检测转染后胃癌SGC-7901细胞活力的变化

CCK-8实验结果显示，转染LV-miR-1284后，随着时间的增长，细胞的活力明显降低。在第72 h和96 h时，LV-miR-1284组与LV-NC-GFP组和control组比较，细胞活力有显著差异(P<0.05)，见图1。

Figure 1.The effect of miR-1284 on the activity of gastric cancer SGC-7901 cells. Mean±SD. n=5. *P<0.05 vs LV-NC-GFP group or control group.

5 miR-1284引起胃癌SGC-7901细胞凋亡与细胞周期阻滞

转染72 h 后，检测细胞凋亡显示，与LV-NC-GFP组和control组比较，LV-miR-1284组凋亡细胞比例显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。检测细胞周期显示，在G0/G1期细胞，与LV-NC-GFP组和control组比较，LV-miR-1284组于G0/G1期细胞比例显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

Figure 2.The effect of miR-1284 on the apoptotic rate of gastric cancer SGC-7901 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs LV-NC-GFP group or control group.

Figure 3.The effect of miR-1284 on the cell cycle distribution of gastric cancer SGC-7901 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs LV-NC-GFP group or control group.

6 miR-1284对胃癌SGC-7901细胞迁移能力的作用

划痕实验结果提示，上调胃癌细胞miR-1284表达后，48 h时 LV-miR-1284组细胞迁移距离为(312.42±16.87)μm，LV-NC-GFP组为(123.63±17.69)μm，control组为(118.95±15.86)μm，对照组较LV-miR-1284组迁移距离明显缩短，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。

Figure 4.The effect of miR-1284 on the migration of gastric cancer SGC-7901 cells (×100). Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs LV-NC-GFP group or control group.

7 生物信息学软件预测靶基因结果和荧光定量PCR检测其在各组细胞中的表达

生物信息学软件预测结果提示，miR-1284可以与JAG1 mRNA的3’UTR区相结合，JAG1为可能的靶基因，见图5。荧光定量PCR检测结果用Ct值表示，与LV-NC-GFP组(-12.42±0.10)和control组(-12.69±0.08)比较，JAG1 mRNA的表达量在转染LV-miR-1284组(-13.28±0.25)显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)。

Figure 5.The results of bioinformatics software seaching to predict the target gene of miR-1284.

8 Western blotting 检测JAG1及其下游相关蛋白表达情况

Western blotting的实验结果表明，与LV-NC-GFP组和control组比较，上调胃癌SGC-7901细胞miR-1284表达后，LV- miR-1284组JAG1、Notch1和NF-κB表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图6。

Figure 6.The comparison of related protein levels in gastric cancer SGC-7901 cells with different treatments. Mean±SD. n=4. *P<0.05 vs LV-NC-GFP group or control group.

讨 论

MicroRNA是一类小的非编码RNA分子，是Lee 等[5]于1993 年在秀丽隐杆线虫的研究中发现的，其长度约为21～25个碱基组成，广泛存在于真核生物中。大多数已知的miRNA分子都和基因的负向调节相关，其主要通过2种机制调节蛋白的表达，一种途径是当miRNA 和编码蛋白质的mRNA 几乎完全配对时，miRNA 诱导mRNA 降解；另一种途径是当miRNA 和编码蛋白质的mRNA 不完全配对时，miRNA 通过不完全的碱基配对结合mRNA 的3′UTR，在转录水平上抑制基因翻译，从而对细胞的增殖、周期、侵袭转移及凋亡发挥调控作用[6]。胃癌中存在众多miRNA表达的异常，其可能通过对肿瘤相关靶基因的调控发挥作用[7-8]。因此，对胃癌中表达异常microRNA进行的研究可为胃癌的临床诊治提供重要的科学理论。

用最新的胃癌miRNA表达谱芯片筛选了与胃癌相关的多个miRNA，Chen等[4]的研究发现，miR-1284在胃癌淋巴结转移阳性组织比原胃癌组织表达少，提示miR-1284极可能在胃癌中表达异常并参与肿瘤发生发展的调控。本文首先研究了miR-1284表达水平与胃癌的相关性，应用荧光定量PCR法对胃癌及匹配癌旁正常组织的miR-1284表达量进行检测，发现胃癌组织表达量显著低于癌旁正常组织，说明正常胃组织普遍高表达。miR-1284表达量与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期和淋巴结转移情况无明显相关，但与组织分化程度有关，且在低分化组织中存在高比例的高表达。进一步在细胞水平的研究发现，过表达miR-1284后胃癌SGC-7901细胞的活力受抑制，细胞周期阻滞于G0/G1期，促进细胞凋亡，并抑制细胞迁移。本研究结果显示miR-1284与淋巴结转移无明显关系，miR-1284过表达抑制细胞迁移，而Chen等[4]的研究表明miR-1284在胃癌淋巴结转移阳性组织比原胃癌组织表达少，与我们细胞实验结果一致，这可能需要更大的临床标本验证。miR-1284在胃癌低分化组织较中高分化组织表达量高，这可能与本研究样本中高分化胃癌组织患者所占数量较少有关。为了进一步探讨miR-1284可能存在的抗肿瘤发生发展的机制，我们利用TargetScan、miRDB和microRNA 这3个预测软件网站，预测miR-1284可能的下游靶基因，结果发现JAG1为其可能的靶基因。而JAG1在多种肿瘤中高表达，且与肿瘤的预后密切相关，在肾上腺皮质癌、乳腺癌中JAG1的表达越高，其预后越差[9-10]。同时有研究表明JAG1是Notch1的激活配体，激活JAG1-Notch1信号通路引起卵巢癌细胞耐药[11]，下调JAG1可引起Notch1功能活性下降[12]。也有研究表明Notch家族是NF-κB的一个基本上游调控因子[13]，且也有研究显示通过阻滞Notch1/NF-κB信号通路抑制胰腺癌细胞侵袭和转移[14]。而我们研究结果显示miR-1284过表达时，JAG1在mRNA和蛋白水平上表达量都降低，结合生物信息学序列配对情况，提示JAG1极可能是miR-1284的直接靶基因，但仍需双萤光素酶报告基因的技术验证。本研究发现JAG1表达下调后，其下游Notch1和NF-κB蛋白表达量降低。而大量研究表明NF-κB表达降低可以促进胃癌细胞凋亡[15]，同时也可以抑制胃癌细胞增殖和迁移[16]，而细胞周期阻滞，进而细胞分裂受阻引起细胞增殖受抑制。这些结果说明miR-1284在胃癌SGC-7901过表达后，极有可能通过抑制JAG1/Notch1/NF-κB信号通路发挥作用。

综上所述，调控JAG1基因可能是miR-1284抑制胃癌生长的重要机制，上调miR-1284的表达，为胃癌的生物学防治提供了一个新的潜在靶标，值得深入研究和进一步验证。

[1] Mishra PJ, Mishra PJ, Banerjee D, et al. MiRSNPs or MiR-polymorphisms, new players in microRNA mediated regulation of the cell: Introducing microRNA pharmacogenomics[J]. Cell Cycle, 2008, 7(7):853-858.

[2] Finnerty JR, Wang WX, Hébert SS, et al. The miR-15/107 group of microRNA genes: evolutionary biology, cellular functions, and roles in human diseases[J]. J Mol Biol, 2010,402(3):491-509.

[3] 林巧爱，李玲玲，巩文辞，等. miR-143在胃癌中的表达及其临床病理意义[J]. 中国病理生理杂志, 2010, 26(9):1674-1678.

[4] Chen W, Tang Z, Sun Y, et al. miRNA expression profile in primary gastric cancers and paired lymph node metastases indicates that miR-10a plays a role in metastasis from primary gastric cancer to lymph nodes[J]. Exp Ther Med, 2012, 3(2):351-356.

[5] Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. TheC.elegansheterochronic genelin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity tolin-14[J]. Cell, 1993, 75(5):843-854.

[6] 罗子华，于晓峰，邹 健. 非编码RNA对肿瘤的调控机制[J]. 国际消化病杂志, 2013, 33(2):97-100.

[7] 张小静，黄伟玲，高 燕，等. 胃癌转移相关miRNA的筛选及生物信息学分析[J]. 肿瘤, 2014, 34(6):507-513.

[8] Song F, Yang D, Liu B, et al. Integrated microRNA network analyses identify a poor-prognosis subtype of gastric cancer characterized by the miR-200 family[J]. Clin Cancer Res, 2014, 20(4):878-889.

[9] Simon DP, Giordano TJ, Hammer GD. Upregulated JAG1 enhances cell proliferation in adrenocortical carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2012, 18(9):2452-2464.

[10]Reedijk M, Pinnaduwage D, Dickson BC, et al. JAG1 expression is associated with a basal phenotype and recurrence in lymph node-negative breast cancer[J]. Breast Cancer Res Treat, 2008, 111(3):439-448.

[11]Liu MX, Siu MK, Liu SS, et al. Epigenetic silencing of microRNA-199b-5p is associated with acquired chemoresistance via activation of JAG1-Notch1 signaling in ovarian cancer[J]. Oncotarget, 2014, 5(4):944-958.

[12]Cohen B, Shimizu M, Izrailit J, et al. Cyclin D1 is a direct target of JAG1-mediated Notch signaling in breast cancer[J]. Breast Cancer Res Treat, 2010, 123(1):113-124.

[13]Schwarzer R, Dörken B, Jundt F. Notch is an essential upstream regulator of NF-κB and is relevant for survival of Hodgkin and Reed-Sternberg cells[J]. Leukemia, 2012, 26(4):806-813.

[14]Wang Z, Banerjee S, Li Y, et al. Down-regulation of Notch-1 inhibits invasion by inactivation of nuclear factor-κB, vascular endothelial growth factor, and matrix metalloproteinase-9 in pancreatic cancer cells[J]. Cancer Res, 2006, 66(5):2778-2784.

[15]Sha M, Ye J, Zhang LX, et al. Celastrol induces apoptosis of gastric cancer cells by miR-21 inhibiting PI3K/Akt-NF-κB signaling pathway[J]. Pharmacology, 2014, 93(1-2):39-46.

[16]Zhang J, Kou YB, Zhu JS, et al. Knockdown of HMGB1 inhibits growth and invasion of gastric cancer cells through the NF-κB pathwayinvitroandinvivo[J]. Int J Oncol, 2014, 44(4):1268-1276.

Expression of microRNA-1284 in gastric cancer and underlying mechanism

WEI Wei-yuan1, CAO Wen-long1, ZHANG Xiao-shi1, ZHAN Ze-xu1, YU Han1, XIE Yu-bo2， XIAO Qiang1

(1DepartmentofGastrointestinalandGlandSurgery,2DepartmentofAnesthesiology,TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China.E-mail:xiaoqiang20050@aliyun.com)

AIM: To evaluate the correlation between microRNA-1284 (miR-1284) and gastric cancer, and to investigate the underlying mechanism. METHODS: The expression of miR-1284 was examined by real-time PCR in 63 gastric cancer (GC) tissue samples and 63 non-malignant adjacent tissue samples. The correlation between miR-1284 and the clinicopathological feature of GC was analyzed. Lentiviral vector containing miR-1284 was constructed and transfected into GC SGC-7901 cells. After transfection, the expression of miR-1284 was examined by real-time PCR. The cell activity was evaluated by CCK-8 assay. The cell cycle and apoptosis were determined by flow cytometry. The ability of cell migration was measured by wound-healing assay. The potential target gene of miR-1284 was predicted by online bioinformatic softwares. The expression of JAG1 mRNA was examined by real-time PCR. The protein levels of JAG1, Notch1 and NF-κB were analyzed by Western blotting. RESULTS: Compared with non-malignant adjacent tissue samples, the results of real-time PCR showed significant downregulation of miR-1284 in 42 GC tissue samples (P<0.05). The expression level of miR-1284 was not significantly associated with age and gender of the patients, tumor size, TNM staging and lymph node metastases (P>0.05), but significantly associated with histologic grading (P<0.05). Compared with LV-NC-GFP group and control group, after transfection of miR-1284 in LV-miR-1284 group, the expression of miR-1284 was significantly increased (P<0.05), the percentages of apoptotic cells and the cells in G0/G1phase were significantly increased (P<0.05), the cells activity and ability of migration were significantly decreased (P<0.05), and the expression of JAG1, Notch1 and NF-κB was significantly decreased (P<0.05). CONCLUSION: The inhibitory effect of miR-1284 on gastric cancer may be associated with the regulation of its targeting geneJAG1.

MicroRNA-1284; Stomach neoplasms; Lentiviral vectors; JAG1

1000- 4718(2015)03- 0440- 07

2014- 09- 12

2014- 12- 09

广西科学技术攻关项目(No. 桂科攻14124004-1-9)

△通讯作者 Tel: 0771-5358325； E-mail: xiaoqiang20050@aliyun.com

R735.2； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.03.010