HPLC法测定米力农注射液中5-羟甲基糠醛的含量

朱正兵，梅泽胜

(海南灵康制药有限公司，海南 海口 570311)

HPLC法测定米力农注射液中5-羟甲基糠醛的含量

朱正兵，梅泽胜

(海南灵康制药有限公司，海南 海口 570311)

目的 建立米力农注射液中5-羟甲基糠醛的含量测定方法。方法高效液相色谱法，采用ODS-C18 (4.6 mm×250 mm，5µm)色谱柱，磷酸氢二钾溶液(取磷酸氢二钾2.7 g，加水800 ml溶解后加三乙胺2.4 ml，用磷酸调节pH值至7.5)-乙腈(85：15)为流动相，流速1.0 ml/min，检测波长为284 nm。结果在0.003~3.103 μg/ml范围内5-羟甲基糠醛的峰面积与浓度具有良好的线性关系，相关系数r=0.999 9，平均回收率为99.50，RSD为0.98%。结论本方法准确，可靠，重复性好，可作为米力农注射液中5-羟甲基糠醛的质量控制方法。

高效液相色谱法；米力农注射液；5-羟甲基糠醛；含量

米力农(Milrinone)化学名2-甲基-6-氧-1，6-二氢-[3，4'二吡啶]-5-甲腈，是人工合成的双吡啶化合物，为非洋地黄、非儿茶酚类强心药，上市的米力农注射液有以无水葡萄糖为辅料和以氯化钠为辅料两种注射液。以无水葡萄糖为辅料生产的米力农注射液，由于葡萄糖在高温或弱酸性条件下脱水易生成5-羟甲基糠醛，该化合物稳定性不好，易分解成乙酰丙酸和甲酸或发生聚合反应，对人体横纹肌和内脏有损害，为全面把握药品质量，保证药品的安全性，我们对米力农注射液中的5-羟甲基糠醛进行研究。

5-羟甲基糠醛(5-HMF)的检查方法通常有控制溶液的颜色、紫外法、双波长法、杂质对照法等。由于5-HMF的最大吸收波长为284 nm，该处干扰较少，UV法常可以作为5-HMF检查的首选方法[3]。但由于原料米力农在284 nm也有较强的吸收，干扰5-HMF的检查。因此参考文献[1-2]选择HPLC法对以葡萄糖为辅料的米力农注射液中5-HMF进行了质量研究，并确定了检查方法。

1 仪器与试药

岛津LC-20AT高效液相色谱仪，SPD-20A紫外检测器，LC-Solution色谱工作站。5-羟甲基糠醛对照品(Sigma公司生产，批号：BCBF6127V，含量：99%)米力农注射液(海南灵康制药有限公司生产，规格：5 ml：5 mg，批号：140601，140602，140603)

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：C18色谱柱(250×4.6 mm，5 μm，ODS2柱，依利特科技有限公司)；流动相：磷酸氢二钾溶液(取磷酸氢二钾2.7 g，加水800 ml溶解后加三乙胺2.4 ml，用磷酸调节pH值至7.5)-乙腈(85：15)；流速：1.0 ml/min，检测波长为284 nm。

2.2 专属性试验 以流动相为空白溶剂；精密称取乳酸适量，加流动相使溶解并稀释制成乳酸浓度为1.0 mg/ml的溶液为含乳酸空白溶液；精密称取米力农适量，加流动相水浴加热溶解并稀释制成浓度为1.0 mg/ml的溶液为含米力农空白溶液；精密称取5-羟甲基糠醛对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 ml中约含2.5 μg的溶液为5-羟甲基糠醛定位溶液；取制备的米力农注射液(批号：140601)为供试品溶液。取上述各溶液20 μl，注入液相色谱仪，色谱图见图1。结果表明，空白溶剂、乳酸和米力农在5-羟甲基糠醛峰相应位置无吸收峰，乳酸、米力农、5-羟甲基糠醛峰的保留时间不同，三者峰分离很好，相互无干扰。

图1 色谱图

2.3 线性关系与范围 精密称取5-羟甲基糠醛对照品约12.5 mg，置25 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1 ml，置于100 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为贮备液，分别精密量取贮备液(编号1、2、3、4、5、6)置于10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得系列溶液，精密量取各溶液20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，结果见表1。结果表明，5-羟甲基糠醛浓度在0.003~3.103 µg/ml浓度范围内，峰面积与浓度线性关系良好。

2.4 精密度试验 精密量取线性试验项下的贮备液5ml，置于10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，照上述色谱条件，精密量取20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，重复进样6次，结果见表2。结果表明，重复进样6次的相对标准偏差(RSD)小于1%，本方法精密度试验良好。

表1 5-羟甲基糠醛线性关系测定结果

表2 精密度试验结果

2.5 稳定性试验 精密量取线性试验项下的贮备液5 ml，置于10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，照上述色谱条件，分别于0、2 h、4 h、6 h、8 h精密量取20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见表3。结果表明：5-羟甲基糠醛溶解在流动相中，室温下放置8 h很稳定(峰面积RSD为0.05%)。

表3 稳定性试验结果

2.6 定量线的测定 在选定的色谱条件下，按信噪比为10：1对最低定量线进行测定。取线性试验项下贮备液，将其逐级稀释，依照上述色谱条件分别进样，记录色谱图，取定量限供试品溶液重复进样6次，保留时间RSD≤2.0%，峰面积RSD≤10%。结果表明：5-羟甲基糠醛定量限为0.06 ng(0.003µg/ml× 20µl；重复进样6次，保留时间RSD为0.05%，峰面积RSD为7.56%)。

2.7 加样回收率试验

2.7.1 加样前米力农注射液中5-羟甲基糠醛含量测定 取米力农注射液(批号：140601)为供试液，精密称取5-羟甲基糠醛对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 ml中约含2.5 μg的溶液，混匀，作为对照品溶液。分别精密量取供试液和对照品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算5-羟甲基糠醛的含量，结果见表4。

表4 加样前米力农注射液中5-羟甲基糠醛含量测定

2.7.2 加样测定 分别精密称取5-羟甲基糠醛对照品(约10 mg、12.5 mg、15 mg)，各3份，置于10 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取1.0 ml置于25 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为备用液。精密量取上述9份备用液各1.0 ml，分别置于25 ml量瓶中，加米力农注射液稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。即得含5-羟甲基糠醛浓度相当于80%、100%、120%的供试品溶液。精密量取上述供试品溶液及对照品溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算测得量，再计算回收率。结果表明：5-羟甲基糠醛回收率均在98.0%~102.0%之间，平均值99.5%RSD为0.98%，小于2.0%；表明本方法准确度良好，误差在充许的范围内，见表5。

2.7.3 三批制备样品5-羟甲基糠醛测定 供试品溶液的制备：取制备的三批米力农注射液，作为供试品溶液。对照品溶液的制备：精密称取5-羟甲基糠醛对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 ml中约含2.5 μg的溶液，混匀，作为对照品溶液。精密量取对照品溶液和供试品溶液各20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法计算本品中5-羟甲基糠醛的含量。结果表明，制备的3批米力农注射液样品5-羟甲基糠醛含量均小于0.025%[3](以葡萄糖计)，见表6。

表5 5-羟甲基糠醛回收率试验结果

表6 三批米力农注射液制备样品中5-羟甲基糠醛含量测定结果

3 讨论

本文提出了以葡萄糖为辅料的米力农注射液中葡萄糖降解产物5-羟甲基糠醛的含量测定方法，根据方法学研究和对样品的检验，发现米力农注射液(含葡萄糖)中5-羟甲基糠醛含量存在，为了保证产品质量，可以考虑将此指标列入质量标准。

本实验建立了米力农注射液(含葡萄糖)中5-羟甲基糠醛含量测定方法，文献[1]报道用高效液相法测定葡萄糖注射液中5-羟甲基糠醛含量，流动相0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(80：20)不能将米力农与5-羟甲基糠醛很好的分离，为了不影响检测结果，参考文献[1]中有关物质项下的方法进行试验，结果空白溶剂无干扰、线性关系良好、重复性试验、回收率试验、稳定性试验均表明该方法良好。

[1]姚会敏,金 焱.HPLC法测定葡萄糖注射液中5-羟甲基糠醛的含量[J].黑龙江医药,2011,24(1)：21-23.

[2]国家药品标准.新药转正标准(D).第73册：105.

[3]邓海星,蒋 煜.5-羟甲基糠醛的检查方法及限度要求初探.国家食品药品监督管理总局药品审评中心.[2005-06-22].http：//www. cde.org.cn/dzkw.do?method=largePage&id=1425.

Determination of 5-hydroxymethyfurfural in milrinone injection by HPLC.

ZHU Zheng-bing,MEI Ze-sheng. Hainan Ling Kang Pharmaceutical Co.,Ltd.,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo establish an assay for determination of 5-hydroxymethyl furfural in milrinone injection by high performance liquid chromatography(HPLC).MethodsHPLC was carried out on a ODS-C18 column(4.6 mm×250 mm,5 μm),with potassium phosphate dibasic solution-acetonitrile(85：15)as the mobile phase,the flow rate of 1.0 ml/min and the detection wavelength of 284 nm.Potassium phosphate dibasic solution was prepared by dissolving 2.7 g potassium phosphate dibasic in 800 ml water,followed by adding 2.4 ml triethylamine,which were then adjusted to pH 7.5 with phosphoric acid.ResultsThe standard curve was in good linearity in the range of 0.003~3.103 μg/ml for determination of its related substances(r=0.999 9).The average recovery was 99.45%,with RSD of 1.02%.ConclusionThe method is accurate,reliable,reproducible and can be used for quality control of 5-hydroxymethyfurfural in milrinone injection.

High performance liquid chromatography(HPLC);Milrinone injection;5-hydroxymethyl furfural;Content

R972+.1

A

1003—6350（2015）09—1373—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.09.0493

2014-10-31)

朱正兵。E-mail：13637552447@163.com