乙型肝炎病毒X基因BCP双变异和CP聚集变异及其临床意义

高 慧，何金花，崔美玲，刘志伟，梁紫甄

（广州市番禺区中心医院检验科，广东 广州 511400）

乙型肝炎病毒X基因BCP双变异和CP聚集变异及其临床意义

高 慧，何金花，崔美玲，刘志伟，梁紫甄

（广州市番禺区中心医院检验科，广东 广州 511400）

目的 探讨广州市番禺区133例乙型肝炎患者血清中HBV X基因区BCP双变异(A1762T/G1764A)和CP聚集变异情况及其临床意义。方法丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)采用速率法；ELISA和PCR法分别检测HBeAg和HBV DNA拷贝数；并以PCR方法扩增HBV X基因，再进行测序，最后将结果分成四组(BCP双变异、CP聚集变异、BCP双变异合并CP聚集变异，无BCP双变异和CP聚集变异)进行综合比较分析。结果(1)HBeAg阳性在BCP双变异组中检出率最低(P＜0.05)；(2)四组HBV DNA拷贝数两两比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；BCP双变异、CP聚集变异HBeAg阳性组的HBV DNA拷贝数均高于HBeAg阴性组(P＜0.05)；(3)四组ALT、AST异常例数检出率差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论乙型肝炎患者常规的相关指标检测对病情的评估尚不全面，在条件许可情况下，对HBV X基因区的BCP双变异(A1762T/G1764A)和CP聚集变异的常见突变位点进行检测，并结合其他临床资料进行综合分析可做出较正确的诊断。

乙型肝炎病毒；测序；X基因；BCP双变异；CP聚集变异

乙型肝炎病毒(HBV)在我国是发病率高、感染力强的传染病[1-2]，HBV X基因的3'末端有调节C基因表达的启动子(CP，nt1643-1849)，包含增强子2(EnhⅡ，nt1672-1743)和基本启动子(BCP，nt1742-1849)，具有广泛的反式激活作用，在HBV的复制和表达中起重要作用[3-4]。BCP最常见的变异是A1762T和G1764A变异，这两个点变异通常同时发生，被称为双突变，该突变已被很多文献报道与肝癌有关[5-8]。增强子2区常见的突变点T1719G、A1726C、A1727T、C1730G常同时发生突变，被称为CP聚集变异，该突变对HBV DNA转录有明显激活作用[9-10]。本研究对133例HBV感染者血清X基因扩增后进行测序，对其中的BCP双变异(A1762T/G1764A)和CP聚集变异进行统计分析，并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2011年6月至2013年6月本院传染科门诊及住院HBV DNA阳性患者133例，其中乙肝携带者36例，慢性肝炎40例，肝硬化34例，肝癌23例；男性108例，女性25例；年龄19~78岁。所有患者均出生于广州市番禺区，并在本区生活至今，血清收集后于-70℃冻存至检测。

1.2 方法 HBeAg采用ELISA法，检测试剂为上海科华生物工程股份有限公司提供；ALT及AST采用速率法，检测试剂为上海复星长征医学有限公司提供；乙型肝炎病毒核酸FQ-PCR试剂由中山大学达安基因股份有限公司提供，仪器为美国ABI公司生产的ABI7500荧光定量PCR仪；血清HBV DNA提取采用经典酚-氯仿抽提法。

1.3 HBV基因型序列 自美国国立生物技术信息中心基因库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/x85254.1)中下载B及C基因型各1个。

1.4 HBV X基因扩增 上游引物序列5'-ctaggctgtgctgccaact-3'，下游引物序列5'-ggaaaaagttgcatggtgct-3'，PCR反应体系为ddH2O 15.3µl、10×扩增缓冲液2.0µl、模版1.0µl、正向引物0.5µl、反向引物0.5µl、dNTP 0.5µl、TaqDNA聚合酶0.2µl、反应总体积20µl；PCR循环参数为预变性95℃5 min；95℃45 s、60℃ 45 s、72℃ 30 s，共9个循环；95℃45 s、57℃45 s、72℃30 s，共34个循环；延伸72℃5 min。PCR产物送至金唯智生物科技有限公司测序部进行测序，测序结果与2个标准B及C基因型序列均不同的碱基即为突变碱基，查找文献中已发表在致病过程起作用的变异位点，比对后再进行统计分析。

1.5 统计学方法 将结果分成四组(BCP双变异、CP聚集变异、BCP双变异联合CP聚集变异，无BCP双变异及CP聚集变异)进行统计，应用SPSS16.0软件进行统计学处理。HBV DNA结果以均数±标准差(±s)表示，采用t检验，检出率采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HBV感染者检出BCP双变异及CP聚集变异情况 133例HBV感染者中，BCP双变异(A1762T/ G1764A)78例，CP聚集变异34例，BCP双变异(A1762T/G1764A)合并CP聚集变异7例。

2.2 四组中HBeAg、HBV DNA、ALT、AST检出情况 HBeAg阳性者在BCP双变异组中检出率最低(χ2=8.068，P=0.045＜0.05)；四组HBV DNA拷贝数两两比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；ALT异常者检出率在四组中差异无统计学意义(χ2=1.261，P=0.738＞0.05)；AST异常者检出率在四组中差异无统计学意义(χ2=2.765，P=0.429＞0.05)，见表1。

表1BCP双变异、CP聚集变异中HBeAg、HBV DNA、ALT、AST检出情况

2.3 BCP双变异、CP聚集变异的HBeAg状态与HBV DNA的关系 BCP双变异HBeAg阳性组HBV DNA为(5.70±1.19)×103、HBeAg阴性组HBV DNA为(4.70±0.99)×103，两者比较差异有统计学意义(t=-3.955，P＜0.05)；CP聚集变异HBeAg阳性组HBV DNA为(6.06±1.06)×103、HBeAg阴性组HBV DNA为(4.49±1.04)×103，两者比较差异有统计学意义(t=-4.246，P＜0.05)。

3 讨论

BCP区是富含AT区域，是肝脏富含因子的独立结合点，变异的BCP可改变这种结合，降低前C区的RNA转录，最终使HBeAg表达减少[11]。本实验表明，四组中BCP双变异组的HBeAg阳性检出率最低，为35.9%(28/78)，与文献报道吻合。HBeAg阳性检出率在CP聚集变异组中最高61.8%(21/34)，这似乎与文献中描述CP变异阻抑了HBeAg产生[12]的现象不完全相同，可能CP聚集变异并未完全消除HBeAg的表达，也可能是本实验的标本例数不够多所导致，还尚待进一步研究。在慢性HBV感染中，HBeAg是临床表达病毒复制较实用的血清标志物，传统认为HBeAg阴转常标志病变活动性的缓解[3]，但以上实验结果表明，HBeAg阴性未必表示病毒复制终止，病情也可能正在向恶化方向发展，尤其要引起临床的注意。

本实验显示，四组中，HBV DNA水平拷贝数两两比较差异均无统计学意义，在BCP双变异及CP聚集变异中，HBeAg阳性组的DNA拷贝数均高于HBeAg阴性组，提示HBV DNA水平与HBeAg阳性关系密切，与HBV X基因是否变异关系不大，可能HBV X基因变异对病毒本身复制没有造成影响，也可能与本实验标本数量有限有关。

HBV X基因变异与血清转氨酶(ALT、AST)的关系文献报道较少，传统的肝功能实验ALT、AST反映病变的活动性、水平升高、病变的活动程度，不过当前对肝功能实验结果评价多是经验性的，本文经过统计后，四组中ALT、AST差异均无统计学意义，提示HBV X基因变异与否对ALT、AST影响未造成差别。

综上所述，乙型病毒性肝炎患者病情轻重是由宿主和病毒两方面所决定，取决于本身的遗传素质，也与病毒的因素密切相关，仅凭传统的血清学实验判断病情的进展明显不足，条件允许的情况下，对HBV感染者的HBV X区的BCP双变异位点及CP聚集变异的常见位点进行检测，可对患者病情的可能发展进行预测并采取有效的防治措施，应对患者长期观察，定期复查，尽量延缓病变的发展。

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Analysis and clinical significance of the BCP double mutation and CP gathered variation in hepatitis B virus X gene.

GAO Hui,HE Jin-hua,CUI Mei-ling,LIU Zhi-wei,LIANG Zi-zhen.Department of Laboratory,Panyu Central Hospital,Guangzhou 511400,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the BCP double mutation(A1762T/G1764A)and CP gathered variation of serum hepatitis B virus(HBV)X gene region and their clinical significance in 133 patients with hepatitis B from Panyu district of Guangzhou.MethodsAlanine aminotransferase(ALT),aspartate aminotransferase(AST) were tested by velocity method.ELISA and PCR were used to detect HBeAg and HBV DNA copy number respectively.The HBV X gene was amplified by PCR and then sequenced.In order to make a comprehensive comparative analysis,the results were divided into four groups：BCP double mutation,CP gathered variation,BCP double mutation merge CP gathered variation,and no mutation.Results(1)The positive rate of HBeAg in BCP double mutant group was the lowest(P＜0.05).(2)Four groups of HBV DNA copy pairwise comparisons showed no statistically significant difference(P＞0.05).The copy number of HBV DNA BCP double mutation and accumulation of CP mutation in HBeAg positive group were higher than that in HBeAg negative group(P＜0.05).(3)The abnormal rates of ALT and AST from the four groups were not statistically different(P＞0.05).ConclusionTo assess the disease of patients with hepatitis B by routine testing of the related indicators is not comprehensive.With permission,combining the common mutations of BCP double mutation(A1762T/G1764A)and CP gathered variation of HBV X gene region with clinical information can help the doctors make more accurate diagnoses.

Hepatitis B virus;Sequencing;X gene;BCP double mutation;CP gathered variation

R512.6+2

A

1003—6350（2015）09—1304—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.09.0468

2014-09-05)

广州市番禺区科技计划项目（编号：2012-Z-03-17）

何金花。E-mail：332518579@qq.com