动脉粥样硬化进程中单核/巨噬细胞IL-1、IL-6的表达

刘艳红

(武汉大学人民医院检验科，湖北 武汉 430060)

动脉粥样硬化进程中单核/巨噬细胞IL-1、IL-6的表达

刘艳红

(武汉大学人民医院检验科，湖北 武汉 430060)

目的 探索脂多糖的作用下单核/巨噬细胞产生的炎症因子与急性冠脉综合征病程的内在关联。方法体外培养人急性单核细胞白血病细胞(THP-1)，实验组加脂多糖，对照组空白，按一定的时间间隔取一定体积培养液，用ELISA检测IL-1β、IL-6、IL-1α浓度，观测其变化情况及何时达到峰值。并对出现峰值最早的IL-1β进行实时定量PCR检测。结果ELISA显示，随着培养时间的延长，浓度也发生相应的改变，IL-1β在3时达到峰值，IL-6在16时达到峰值，IL-1α在18时达到峰值。实验组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。结论脂多糖影响巨噬细胞IL-1β、IL-6、IL-1α的表达；达到峰值的时间不同，说明IL-1α、IL-1β、IL-6可能在不同的时间起主导作用。

白介素-1β；白介素-6；白介素-1α；脂多糖；动脉粥样硬化

急性冠脉综合征(Acute coronary syndrome，ACS)主要是由于动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)导致的心血管疾病，近年来已发展成为危及人类健康的主要疾病之一[1]。近10多年的研究成果已经证实AS是血管壁的慢性炎症过程，炎症反应贯穿其发生、发展和预后。大量的单核/巨噬细胞经趋化因子诱导出现在不稳定的粥样斑块内，激活后可产生多种蛋白酶，降解破坏细胞外基质成分，同时可分泌多种炎性因子，如IL-1α、IL-1β、IL-6等[2]，它们通过影响血管内皮细胞、平滑肌细胞以及巨噬细胞自身在AS和ACS发病中起一定作用，我们探讨炎症性细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6在脂多糖(LPS)诱导的人单核/巨噬细胞中产生的变化，从而揭示其在AS病程中可能的相互关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料 THP-1细胞系(本实验室保存)；LPS试剂购自Sigma公司；1640培养基和胎牛血清(美国Gibco公司)；IL-1α的ELISA试剂盒(产品编号EK0410)，IL-1β的ELISA试剂盒(产品编号EK0389)，IL-6的ELISA试剂盒(产品编号EK 0392)均由武汉博士德生物工程有限公司提供。凝胶成像扫描系统(美国Bio-Rad公司)；UV-265紫外可见分光光度计(日本岛津)；PCR仪(PTC-225，MJ research公司)；荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 用含抗生素的1640培养基培养细胞，培养基中含10%胎牛血清。饱和湿度及5% CO2条件下进行细胞传代培养。

1.2.2 LPS处理THP-1细胞 待细胞培养密度到85%以上，等体积无血清的培养基同步化细胞2 h，用1%血清的低营养培养基2 ml重悬细胞，并加入LPS(终浓度为10 ng/ml)，置培养箱孵育，分别在0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h、11 h、12 h收集培养基，放入对应EP管，4℃冻存待测IL-1β；分别在0 h、3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、16 h、17 h、18 h、19 h、20 h、21 h、22 h、23 h、24 h、25 h收集培养基，放入对应EP管，4℃冻存待测IL-1α和IL-6。分别于0 h、1 h、2 h、4 h收集细胞，实时定量检测IL-1β的表达。

1.2.3 ELISA法测IL-1、IL-6浓度 按照试剂盒说明书检测样本IL-1、IL-6浓度。

1.2.4 实时定量PCR检测IL-1β的表达 提取总RNA，内参18SrRNA上游引物为5'-CGGCTACCA CATCCAAGGAA-3'，下游引物为5'-GCTGGAATTA CCGCGGCT-3'；目的基因 IL-1β上游引物为5'-AATGATGGCTTATTACAGTGGCA-3'，下游引物5'-GCTGTAGTGGTGGTCGGAGATT-3'。配制实时定量逆转录PCR反应液：SYBR Premix ExTaq(2×) 12.5 μl，上游引物(20 μmol/L)1 μl，下游引物(20 μmol/L) 1 μl，逆转录产物2 μl，加灭菌蒸馏水至总体积至25 μl。PCR扩增条件为：IL-1β95℃预变性3 min，然后95℃30 s、63℃30 s、72℃30 s，40个循环；内参18 s rRNA 95℃预变性3 min，然后95℃30 s、58℃30 s、72℃30 s，40个循环。结果处理：相对定量2-ΔΔCt法，ΔCt(实验组)=Ct(实验组目的基因)-Ct(实验组内参基因)，ΔCt (对照组)=Ct(对照组目的基因)-Ct(对照组内参基因)，ΔΔCt=ΔCt(实验组)-ΔCt(对照组)，表达倍数=2-ΔΔCt。

1.3 统计学方法 应用统计分析软件Graph-PadPrism5版对实时定量PCR结果进行统计学分析。每组实验重复3次，每次实验有3个重复值。计量数据以均数±标准差(±s)表示，两组间均数的比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA检测IL-1β浓度的时间曲线 LPS作用THP-1细胞后，按照一定的时间收集培养基，使用ELISA方法检测IL-1β的浓度。第3小时IL-1β的积累浓度达到峰值，此时IL-1β的浓度为33.484 4 pg/ml，然后迅速降低维持正常量，见图1。

2.2 ELISA检测IL-6浓度的时间曲线 LPS作用THP-1细胞后，按照一定的时间收集培养基，使用ELISA方法检测IL-6的浓度。第16小时IL-6的积累浓度达到峰值，此时IL-6的浓度为33.487 5 pg/ml，然后迅速降低维持正常量，见图2。

图1 IL-1β浓度的时间曲线

图2 IL-6浓度的时间曲线

2.3 ELISA检测IL-1α浓度的时间曲线 LPS作用THP-1细胞后，按照一定的时间收集培养基，使用ELISA方法检测IL-1α的浓度。第18小时IL-1α的积累浓度达到峰值，此时IL-1α的浓度为75.780 4 pg/ml，然后迅速降低维持正常量，见图3。

图3 IL-1α浓度的时间曲线

2.4 实时定量检测IL-1β的表达 对最早达到峰值的IL-1β，通过实时定量PCR检测其在LPS作用下的表达情况。对照组的mRNA水平为(1.211±0.2120)，LPS作用THP-1细胞1 h后表达量达到(3.294±0.7220)，是对照组的2.72倍；2 h后达到(5.631±1.0570)，是对照组的4.65倍，差异有统计学意义，见图4。这与ELISA检测的结果相吻合。

图4 LPS对THP-1细胞IL-1β mRNA表达的影响

3 讨论

AS是导致众多心脑血管疾病的主要原因之一，严重危害人类健康，深入研究AS发病的机制意义重大。1999年Ross明确提出“AS是一种炎症性疾病”，因此感染因素在AS的发生与发展中所扮演的角色得到大量研究者的重视。LPS是革兰氏阴性菌的内毒素，其作用于参与心血管事件的各类型细胞，比如：内皮细胞、血管平滑肌细胞、单核/巨噬细胞等就成为观察AS在模拟炎症状态的有效的细胞模型。随着研究的不断深入，发现了大量参与AS的炎性因子，并且它们在AS的不同发展阶段得到表达。这些炎症因子作为一种介质，作用于参与AS形成的内皮细胞、单核/巨噬细胞、淋巴细胞、平滑肌细胞、血小板等，并通过自分泌以及旁分泌的形式使它们相互联系，相互影响[3]。因此，探讨AS炎症过程的相关因子，研究这些炎症因子在整个AS发生、发展过程中的浓度变化，对了解动脉粥样硬化的进程有一定的意义。本文选择了IL-1α、IL-1β、IL-6三种白介素作为检测AS炎症进程的指标。

IL-6由多种免疫细胞产生，参与细胞的增殖、分化以及机体免疫应答的调节，是机体抗感染免疫反应的重要介质[4]。AS斑块中发现有IL-6的表达，可能通过促进基质金属蛋白酶(MMPs)和TNF-α的表达导致斑块不稳定。研究显示ACS患者循环血液中的IL-6含量高于稳定性心绞痛患者以及健康对照，不稳定型心绞痛患者如果入院后48 h IL-6水平较入院时升高，则易发生联合终点事件，包括死亡、心肌梗死或顽固性心绞痛[5]。

IL-1β是一种炎性细胞因子，具有多种致AS发生的生物学效应[6]。它主要由活化的巨噬细胞产生，内皮细胞，平滑肌细胞，成纤维细胞也能产生IL-1。研究表明IL-1β通过促进平滑肌细胞增生、促进白细胞粘附于内皮、调节低密度脂蛋白(LDL)代谢、诱导MMPs合成、增加血管通透性、抑制血管收缩以及增加促凝活性参与血管功能的调节[7]。因此IL-1可能参与了AS的发病以及球囊扩张术后血管内皮的损伤愈合过程。

实验数据显示：LPS刺激THP-1细胞，三种白介素累积量达到高峰值时间和浓度各不相同，IL-1β在LPS刺激3 h即达到高峰，说明IL-1β产生时间最早，产生速率快，可能在炎症反应的早期起作用。IL-1α和IL-6分别于18 h和16 h达到高峰，产生速率较慢，可能在炎症后期起作用。有资料显示动脉粥样硬化过程中IL-1β的产生对IL-6的产生有促进作用：在IL-1β存在的情况下，IL-6各阶段累积量多，而在缺乏IL-1β的情况下，IL-6累积量显著减少。实验数据显示IL-1β开始产生与达到峰值都先于IL-6，一定程度上可验证这一说法。同时有研究表明IL-1β可诱导IL-6合成。

巨噬细胞浸润，形成泡沫细胞是AS的标志[8]，其产生炎症因子随时间的变化在一定程度上反映了动脉粥样硬化的程度，LPS诱发THP-1细胞的反应表明IL-1α、IL-1β、IL-6可能在不同的时间起主导作用，同时相互之间有一定促进依存关系。借此对疾病的诊断有一定的帮助。

[1]张明娇,李珉珉.急性冠脉综合征易损斑块生物学标志物的研究进展[J].临床检验杂志,2015,33(1):49-51.

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[3]莫文魁,陈群清.体外循环对脑血管影响的研究进展[J].广东医学,2013,34(15):2422-2424.

[4]张红超,于鲁峰,李玲可,等.白细胞介素-6在全身炎症反应中对冠脉内皮细胞的作用[J].中华实验外科杂志,2008,25(10): 1292-1293.

[5]王守力,韩雅玲,刘丽军,等.不稳定性心绞痛患者血浆白细胞介素-6和高敏C反应蛋白的变化[J].中华老年心脑血管病杂志, 2008,10(6):434-436.

[6]靳梦醒,闫 海,程艳伟,等.辛伐他汀对oxLDL诱导的巨噬细胞活性氧及IL-1β分泌的影响[J].中国药理学通报,2014,30(5): 692-696.

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[8]Libby P,Ridker PM,Hansson GK.Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis[J].Nature,2011,473(7347): 317-325.

Expression of IL-1 and IL-6 of macrophages in the process of atherosclerosis.

LIU Yan-hong.Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,Hubei,CHINA

ObjectiveTo explore the relationships between acute coronary syndrome and inflammatory factors which were produced by macrophages with lipopolysaccharide(LPS).MethodsThe THP-1 cells were culturedin vitroand divided into research group and control group at random.LPS was used in the research group,but not in the control group.The concentration of interleukin-1β(IL-1β),interleukin-1α(IL-1α),interleukin-6(IL-6)were determined by ELISA.The expression of IL-1βwas determined by real time PCR.ResultsThe results of ELISA showed that the concentrations of IL-1β,IL-1α,IL-6 were changing with time courses.The peak value of IL-1βwas observed at 3 h,with that IL-6 observed at 16 h and that of IL-1αobserved at 18 h.The differences between the research group and the control group were statistically significant(P＜0.05).ConclusionThe LPS affects the expression of IL-1β,IL-6,IL-1αof macrophages,with the peak values observed at different time points,which indicates that IL-1β,IL-6 and IL-1αplay the leading role at different times in the process of acute coronary syndrome.

Interleukin-1β(IL-1β);Interleukin-6(IL-6);Interleukin-1α(IL-1α);Lipopolysaccharide (LPS);Atherosclerosis(AS)

R541.4

A

1003—6350（2015）19—2818—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.19.1028

2015-03-25)

国家自然科学基金(编号：81170273)

刘艳红。E-mail：1376090683@qq.com