神经降压素类似物的固相合成

王小青，李松涛，宫闻婧，尹志峰，王良友

(1.承德医学院 河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000;2.承德天创生物制品有限公司，河北 承德 067000)

神经降压素(NT)是1973 年美国生理学家Carraway 和Leeman［1］在分离牛的下丘脑P 物质时，发现的一种能使毛细血管通透性增加、皮下血管扩张以及短暂降低动脉血压的物质。NT 由13 个氨基酸残基组成，氨基酸序列为pGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu，具有广泛的生物学功能［2-5］。NT 具有开发成为安定药、镇痛药和降压药［6-7］的应用前景。同时，NT 具有高活性、作用快速等特点，能迅速降低人或动物的血压，在军用失能剂开发方面具有一定的潜力。

NT 游离羧基端是受体主要结合部位，决定其生物活性。在血液循环和组织中，NT 被作用于羧基端的金属内切肽酶缓慢灭活，主要降解部位是Arg8-Arg9，Pro10-Tyr11及Pro7-Arg8三处肽键［8］。NT 作为军用失能剂开发，需作用迅速，持久，并且不易失活。本文设计将神经降压素的Pro7替换成Ser7，可能会避免被金属内切酶识别而失去活性，以Fmoc 固相合成策略，合成了神经降压素类似物(Neurotensin analogue，NTA)，氨基酸序列pGlu-Leu-Tyr-Glu-Asn-Lys-Ser-Arg-Arg-Pro-Tyr-Ile-Leu，分子量1 663.1，并优化了裂解条件，为进一步研究其降压活性提供物质基础。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

Wang Resin(替代度为1.14 mmol/g)，天津南开合成科技有限公司;Fmoc 保护的氨基酸包括Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-Ser(tBu)-OH，Fmoc-Tyr(tBu)-OH，Fmoc-Asn(Trt)-OH，Fmoc-Leu-OH，Fmoc-pGlu-OH，Fmoc-Ile-OH 均购自成都诚诺新技术有限公司;缩合试剂1-羟基苯并三氮唑(HOBt)，N，N-二异丙基碳二亚胺(DIC)由苏州中科天马肽工程中心有限公司提供;醋酸酐、哌啶、三氟乙酸(TFA)、甲醇、二氯甲烷(DCM)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、冰乙醚均为分析纯;乙腈，色谱纯;超纯水，实验室自制。

Agilent Technologies 1200 型高效液相色谱仪;Newstyle 型反相高效制备液相色谱仪;Heal Force 纯水机;LGJ-18 型冷冻干燥机;TDL-40B 型高速离心机;Spectrum-752 型紫外分光光度计;AR224CN 型分析天平;RE-52AA 型旋转蒸发器。

2 结果与讨论

2.1 固相合成

2.1.1 合成路线 见图1。

图1 NTA 的合成路线Fig.1 The synthetic routes of NTA

2.1.2 肽树脂的制备 在洗净并干燥的反应柱中，加入0.877 2 g(1 mmol)wang 树脂，加DMF 通氮气溶胀30 min，充分溶胀后抽掉DMF，用DMF 和DCM分别洗涤树脂，抽干溶剂。称0. 779 g (2 mmol)Fmoc-Leu-OH、0.324 2 g HOBt(2.4 mmol)与0.024 4 g(0.2 mmol)DMAP 溶于DMF，冰浴并加入0.37 mL(2.4 mmol)DIC 活化5 min，加入反应柱反应1.5 h，抽干，分别用DMF 与DCM 洗涤树脂，并进行替代度检测，加入11 mL 的醋酸酐与吡啶(V/V，6 ∶5)混合液封闭14 h。冲洗树脂，加甲醇收缩2 次(5 min/次)，减压干燥至恒重，得干燥树脂。按照合成路线，依次偶联氨基酸，甲醇收缩树脂，抽干并称重得肽树脂1.55 g。

2.1.3 裂解与沉淀 置上述肽树脂于茄形瓶中，加入裂解液TFA/间甲酚/EDT(95 ∶3 ∶2)16 mL，室温下反应2 h。脱脂棉过滤，用少许TFA 洗涤树脂，将滤液倾入160 mL 无水冰乙醚中，析出白色固体，0 ℃静置沉降20 min。4 000 r/min 离心4 min，弃去上清液，重复5 次，真空干燥至恒重，得(1)粗肽1.13 g。

2.2 粗肽分析

2.2.1 高效液相色谱分析 色谱柱Agela C18 柱(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)，流动相:A 水(0. 1%TFA)，B 为乙腈(5% 水，0. 1% TFA)，B 相5% ～95% 梯度洗脱20 min，进样量为5 μL，流速 为0.8 mL/min，检 测 波 长215 nm。粗 肽 纯 度 达91.82%(面积归一化法)，分析结果见图2。

图2 粗肽高效液相分析图谱Fig.2 The HPLC chromatogram of the crude peptide

2.2.2 质谱分析 取适量粗肽进行ESI-MS 分析，可知双电荷离子峰为m/z 832.5［M+2H］2+与理论值832.56 一致，三电荷离子峰m/z 555. 3［M +3H］3+与理论值555.37 一致。分析结果见图3。

图3 ESI-MS 分析图谱Fig.3 The chromatogram of ESI-MS

由图3 可知，氨基酸序列中含有2 个Arg 与1个Lys，在进行ESI-MS 鉴定时，易失去两个到三个H，从而带有两个到三个电荷，即［M +2H］2+与［M+3H］3+。

2.3 纯化与转盐

(1)粗肽称重，50%乙腈超声溶解，0.45 μm 有机微孔滤膜过滤，经制备型RP-HPLC 分离纯化，色谱柱Hedera ODS-2(20 mm ×250 mm，10 μm)制备柱。流动相:A 为水(0.3% HAc)，B 为乙腈，流速为15 mL/min，B 相22% ～32%梯度洗脱30 min，检测波长215 nm。分段收集主峰，合并经RP-HPLC检测纯度＞98%的组分，减压浓缩除去乙腈，冷冻干燥得(1)纯品0.665 g。分析图谱见图4，多肽总收率= 纯肽实际重量/理论量× 100% = 665 mg/1 mmol×1 663.1 g/mol=39.99%。

图4 NTA 纯化后分析图谱Fig.4 The HPLC chromatogram of NTA

2.4 结构确证

取(1)纯品进行ESI-MS 分析，可知双电荷离子峰为m/z 832.5［M+2H］2+与理论值832.56 一致，三电荷离子峰m/z 555. 3［M + 3H］3+与理论值555.37 一致。

2.5 裂解体系的选择

称取100 mg 缩合后的肽树脂，反应温度30 ℃，不同比例的裂解试剂分别反应2 h，所得结果见表1。

表1 裂解体系对粗肽收率的影响Table 1 The cleavage reagent affects the yield of crude peptide

由表1 可知，采用方法3 TFA ∶EDT ∶间甲酚(95 ∶4 ∶1)切割试剂的配方，可以取得最好的切割效果。NTA 的Fmoc 保护氨基酸侧链保护基主要有tBu、Boc、Pbf 与Trt 四种，TFA 对tBu、Boc、Pbf 与Trt几种保护基的脱除均有较好的捕获效果，同时EDT与苯甲硫醚能增强对tBu 裂解时产生的碳正离子的捕获，间甲酚能够更好的防止切割捕获不完全造成的粗肽纯度降低的问题。

2.6 肽树脂与裂解试剂比例对粗肽收率及纯度的影响

以TFA∶间甲酚∶EDT 为裂解体系，对不同肽树脂与裂解试剂的比例进行实验，考察料液比对粗肽收率的影响，结果见表1。肽树脂与裂解试剂为1∶10 时粗肽的收率及纯度较好。

表2 料液比对粗肽收率的影响Table 2 Liquid ratio affects the yield of crude peptide

3 结论

本文采用Fmoc 固相多肽合成方法，以Fmoc 保护氨基酸为原料，Wang Resin 为载体，经DIC/HOBT缩合，TFA/间甲酚/EDT 裂解体系脱除保护基，经RP-HPLC 纯化并转为醋酸盐。获取了经RP-HPLC分析为单一峰的目的肽，总收率为39.99%。

［1］ Caryaway R E，Leeman S E.The isolation of a new hypotensive peptide，neurotensin from bovine hypothalamus［J］.Biol Chem，1973，248(19):6854-6861.

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