苦皮藤素的提取、鉴定与杀虫效果实验研究

2015-04-14黄四平杨光王小利常丹

应用化工 2015年12期

黄四平，杨光，王小利，常丹

(咸阳师范学院化学与化工学院，陕西咸阳 712000)

苦皮藤素膏是从多年生木本卫矛科南蛇藤属植物中提取出来的植物源杀虫抑菌剂，是多种β-二氢沉香呋喃多元醇酯类化合物的混合物［1］，是我国具有开发潜力的一类高效低残留蔬菜杀虫抑菌药［2］。1988 年Wakabayashi 等［3］以苦皮藤为原料，从中分离并鉴定出具有杀虫活性的苦皮藤素开始，苦皮藤素的提取及工艺、化学成分分析、结构鉴定及结构修饰、杀虫机理及杀虫效果等方面都有了深入研究，特别是西北农林科技大学的吴文君课题组，在这一方面作出了杰出贡献。在提取方面，吴文君课题组［4-6］采用浸提、层析、重结晶分离提纯了数十种苦皮藤素化合物，并对其中一些化合物进行了红外光谱、质谱分析。王国亮等［7］以石油醚为提取剂采用索氏提取器常规法从苦皮藤干种子粉中提取了苦皮藤素，出油率达干重的22.6%。魏亚丽等［8］采用回流法，以苦皮素A 的含量和浸膏量为综合指标，采用正交实验设计了实验，优选了实验提取工艺。在化学成分分析方面，朱靖博等［9］采用反复正相硅胶层析与半制备型高效液相色谱结合方法从苦皮藤中得到3 个化合物，并给出了化合物的1H NMR、13C NMR谱。吴文君等［10］先浸提的方法分离出了苦皮藤素Ⅰ-Ⅶ后，又采用生物活性追踪方法，从苦皮藤的根皮中分离5 个对粘虫有毒杀作用的新化合物，并给出了新化合物的红外光谱、高分辨质谱特征。在结构及结构修饰方面，陈玲等［11］给出了苦皮藤素Ⅲ和苦皮藤素XIX 的1H NMR 和13C NMR 谱特征和DEPT、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC 等二维2D NMR 特征。张继文等［12］根据天然杀虫活性物质苦皮藤素V 分子结构含特征，采用常规方法合成了苦皮藤素V 的酯、酮及醚衍生物，其结构经1H NMR 确认，并采用叶碟饲虫法，测定了合成衍生物对粘虫的杀虫活性。邵严亮［13］等以1β，2β，4α，6α，8β，9α，13-七羟基-β-二氢沉香呋喃为起始原料合成了7 个双呋喃二氢沉香呋喃醚类衍生物，以室内人工累代饲养的3 龄粘虫幼虫为试虫，采用载毒叶片法测定了杀虫活性。在杀虫效果及机理方面，祁志军等［14］采用灌胃法与蓄积毒性试验法研究了0.2% 苦皮藤素乳油对鹌鹑的急性毒性与蓄积毒性，结果表明该乳液对鸟类低毒，但在鹌鹑体内轻度蓄积。徐河山等［15］证明了苦皮藤根粉中的苦皮藤素V 通过破坏粘虫幼虫的肠肠壁细胞膜及细胞器膜对粘虫、稻苞虫、棉小造桥虫、棉大卷叶螟和菜青虫等幼虫具有胃毒和麻醉作用。姜自德等［16］研究了1%苦皮藤素乳油对书虱的防治效果表明，施药后一天就可以达到95%以上的防治效果，且持效期可达10 d 以上。

本文通过回流法从采集于陕西省宁陕县火地塘林场的苦皮藤中提取了苦皮藤素膏，通过高效液相色谱对其进行了分离与结构鉴定，并研究了其光谱性质进行了初步杀虫实验。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

丙酮、甲醇、乙酸乙酯、石油醚、羧甲基纤维素钠、薄层层析硅胶均为分析纯;苦皮藤，陕西省宁陕县火地塘。

101A-1B 型鼓风干燥箱;RE-52AA 旋转蒸发器;BS224 S 型精密电子天平;800 型离心机;IRPrestige-21 型傅里叶变换红外光谱仪;DK-98-1 型紫外可见分光光度计;2W 阿贝折光仪;LC-10AT 高效液相色谱仪。

1.2 实验过程

1.2.1 实验提取过程准确称取苦皮藤根皮粉末30 g，经过回流装置回流，以甲醇为溶剂，提取温度为50 ℃，苦皮藤粉与提取液的比为1∶6，选择回流次数为3 次，每次提取的时间为2 h，即向回流装置中加入160 mL 的甲醇，进行回流2 h，对回流液进行收集，再次用160 mL 溶剂过2 h，对回流液进行收集，再次分别用提取溶剂提取2 h，对回流液进行收集，合并3 次滤液。用旋转蒸发器处理收集的溶液。

1.2.2 实验检测过程

1.2.2.1 折光率测定利用阿贝折光仪对提取物进行折光率的测定，实验对甲醇溶解的不同浓度的提取物溶液的折光率的测定，同一浓度的溶液检测3 次，求其平均值。

1.2.2.2 紫外分光光度计的检测取少量苦皮藤提取物，用甲醇溶解为0.002 g/mL，通过紫外分光光度计进行检测。

1.2.2.3 红外光谱测定将提取物用甲醇溶解，滴至溴化钾薄片上，再用溴化钾薄片盖压，经傅里叶变换红外光谱(FTIR)仪检测。

1.2.2.4 高效液相色谱测定经提纯后的1%苦皮藤素浸膏1 mL，用甲醇超声溶解定容至100 mL后，用0.4 μm 有机膜过滤，用HPLC 测含量。

色谱条件:色谱柱的柱长及直径250 mm ×4.6 mm，0.45 μm 用色谱纯甲醇和用水膜过滤的蒸馏水，体积比为8∶2;流速为1.0 mL/min;检测波长为230 nm;柱温为25 ℃;进样量为10 μL。

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1.2.2.5 杀虫效果初步实验胃毒活性测定采用叶片载毒饲虫法［17］:将样品溶液用丙酮稀释成20 mg/mL的溶液，然后点2 μL 在0.25 cm2的卷心菜叶片上，使丙酮挥发掉。将饥饿8 h 的蟋蟀试虫分头放在培养皿里，用点过样品的叶片喂养。24 h后，查看其死亡率。

2 结果与讨论

2.1 折光率测定结果

苦皮藤素折光率测定见表1。

表1 苦皮藤素折光率测定Table 1 The refractive index of the Celangulin cream

由表1 可知，苦皮藤素的浓度不同，折光率有所不同;浓度越低，折光率越低。其折光率范围在1.32～1.33。说明苦皮藤浸膏是由多种纯苦皮藤素的混合而成。

2.2 紫外光谱测试结果

苦皮藤素浸膏紫外光谱见图1。

图1 苦皮藤素浸膏紫外光谱Fig.1 UV of the Celangulin cream

通过紫外光谱图可知，该苦皮藤浸膏在256 nm有吸收峰，且吸收强度为弱吸收，为苯环类的b 带吸收。说明苦皮藤素中有苯环存在。

2.3 红外光谱测定结果

由红外光谱可明显观测到，在波数 υmax3 544 cm－1到3 430 cm－1的宽峰，结合1 300 ～1 500 cm－1附近是有氢键缔合的O—H 变角振动峰，说明为苦皮藤素中自由羟基O—H 伸缩振动特征吸收峰;在波数υmax为1 680 cm－1附近出现的强吸收峰，为苦皮藤素中酯基—COO—的特征吸收，结合波数为1 200 cm－1左右的吸收峰，这正是—COO—的吸收峰。由图还可以看出，在1 090 ～1 140 cm－1的吸收峰是仲、叔醇类。1 427.80 cm－1附近则是—CH2—的变形伸缩振峰这也正是—CH2—的吸收峰。苦皮藤素为多元醇酯类化合物。

图2 苦皮藤素浸膏红外光谱Fig.2 IR of the Celangulin cream

2.4 高效液相色谱测试结果

图3 样品溶液色谱图Fig.3 Chromatogram of sample solution

经过与标准图谱对照，该苦皮藤浸膏中含有3种苦皮藤素成分，且在一定浓度范围内，苦皮藤素的峰面积与质量浓度具有线性关系。根据参考文献［2］，浸膏中苦皮素A 的质量分数=(CA×稀释倍数×V滤)/(浸膏质量g)

式中 CA——待测品中苦皮素A 的质量浓度，mg/mL;

V滤——滤液的体积，mL。

式中 CA——待测品中苦皮素A 的质量浓度，mg/mL;

A样——待测品峰面积;

C标——对照品中苦皮素A 的质量浓度，mg/mL;

A标——对照品峰面积。

原料中苦皮素A 的质量分数=(CA×稀释倍数×V滤)/(原料质量g)

经计算，苦皮藤素浸膏中苦皮藤素的含量最大可达14.3%。

2.5 杀虫实验结果

结果表明，苦皮藤素类浸膏对蟋蟀成虫有明显的胃毒活性，在上述实验浓度下，对蟋蟀成虫的胃毒活性(死亡率)分别为90%以上。

3 结论

(1)回流法对陕西苦皮藤素有较好的提取效果，经分析后，其中的苦皮藤素浸膏中苦皮藤素的含量最大可达14.3%。

(2)杀虫实验证明，陕西苦皮藤素浸膏对蟋蟀成虫有较好的毒杀作用，在24 h 内对蟋蟀成虫的杀灭率达90%以上。

［1］李衍方，刘玉玲，宋湛谦.杀虫植物苦皮藤的研究新进展［J］.农药，2006，45(3):148-151.

［2］黄四平，常丹，王小利，等. 浸渍法提取苦皮藤素的工艺条件研究［J］.应用化工，2015，44(1):87-91.

［3］ Wakabayashi N，Wu W J，Waters R M，et al.Celangulin:A nonalkaloidal insect antifeedant from chinese bittersweet，celastrus angulatus［J］. Journal of Natural Products，1988，51(3):537-542.

［4］刘惠霞，吴文君，王美珍.苦皮藤根皮的红外光谱特征及其在鉴别中的应用［J］. 西北植物学报，1998，18

(2):305-310.

［5］张继文，吴文君，田暄.苦皮藤素类似物的合成与结构鉴定［J］.农药学学报，2004，6(3):21-25.

［6］吴文君，胡兆农，刘惠霞，等. 苦皮藤主要杀虫有效成分的杀虫作用机理及其应用［J］. 昆虫学报，2005，48

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［7］王国亮，南蓬，龚复俊，等. 昆虫拒食剂新资源——苦皮藤果油的化学成分研究初报［J］.武汉植物学研究，

1989，7(3):301-302.

［8］魏亚丽，吴鸣建，赵天增.植物源杀虫剂苦皮藤素的提取新工艺研究［J］.河南科学，2008，26(1):31-34.

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［10］吴文君，王明安，朱靖博，等. 杀虫植物苦皮藤毒杀成分的研究［J］.有机化学，2002，22(9):631-637.

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［12］张继文，姬志勤，吴文君.苦皮藤素V 的结构修饰及生物活性［J］. 西北农林科技大学学报:自然科学版，2004，32(10):99-102.