RP-HPLC 测定山竹花不同部位芦丁、木犀草素的含量

2015-04-14梁春辉张寒任连新

应用化工 2015年12期

梁春辉，张寒，任连新

(1.西安市儿童医院，陕西西安 710083;2.西安医学院药学院，陕西西安 710021;3.华北制药股份有限公司，河北石家庄 051430)

山竹花(Disporam cantoniense (Lour.)Merr.)别名万寿竹、豪猪七、白毛七、竹叶参等，产于秦岭北坡甘肃天水的小陇山、陕西太白山及南坡之略阳、佛坪、宁陕和甘肃、成诸县等。山竹花生长海拔高度700 ～3 000 m，多见山坡灌丛中或林下草地，喜肥沃而湿润的腐殖土。其以根及根茎入药，性寒味甘，具有清热解毒、舒筋活血之功效，民间常将其用于治疗痛经、跌打损伤、风湿关节痛、骨折等症［1-2］。

目前，国内相关文献报道山竹花中含有芦丁、木犀草素、芹菜素、木犀草素-7-O-β-D-葡萄吡喃糖苷等黄酮类成分［3］。目前国内外尚未见山竹花中黄酮类含量测定的相关记载，本文在参考了大量有关山竹花和黄酮类化合物提取分离及含量测定的文献资料后，分别以芦丁和木犀草素为对照品对山竹花进行了不同部位(叶、茎、根)中芦丁和木犀草素的含量测定。另外，由于山竹花中含有木犀草素-7-Oβ-D-葡萄吡喃糖苷等苷类成分，而苷类在酸性条件下易发生水解，本文在实验过程中将用于测定木犀草素的样品溶液进行酸处理，再次测定该样品中木犀草素的含量，并与未经酸处理的样品测得的结果进行了比较。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

芦丁对照品(HPLC 检测用，纯度≥98%);木犀草素对照品(HPLC 检测用，纯度≥98%);甲醇，色谱纯;其它试剂均为分析纯;山竹花采自秦岭太白山，经西安医学院生药教研室汪兴军老师鉴定为百合科山竹花。

Agilent 1260 高效液相色谱仪;Thermo C18柱色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);KQ-300B 型超声波清洗器;GR-202 型分析天平。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件与系统适用性

1.2.1.1 芦丁色谱柱:Thermo C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，柱温30 ℃，进样量20 μL，流动相:甲醇-0.1%磷酸水溶液(38∶62);流速1.0 mL/min;检测波长358 nm。在此色谱条件下，芦丁分离度较好［4-8］，见图1。

图1 芦丁对照液色谱图Fig.1 Rutin control the liquid chromatogram

1.2. 1. 2 木犀草素色谱柱:Thermo C18柱(250 mm × 4. 6 mm，5 μm)，柱温30 ℃;进样量20 μL;流动相:甲醇-0.2%磷酸水溶液(55∶45)，流速1.0 mL/min，检测波长350 nm。在此色谱条件下，木犀草素分离度较好［9-10］，见图2。

图2 木犀草素对照液色谱图Fig.2 Luteolin control liquid chromatogram

1.2.2 对照品溶液的配制

1.2.2.1 芦丁对照品溶液的配制精密称定芦丁对照品3.9 mg，以60%乙醇并转移至10 mL 容量瓶中，定容，即得每1 mL 含芦丁0. 39 mg 的对照品溶液。

1.2.2.2 木犀草素对照品溶液的配制精密称定木犀草素对照品3.4 mg，以100%甲醇溶解并转移至10 mL 容量瓶中，定容，即得每1 mL 含木犀草素0.34 mg 的对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的配制

1.2.3.1 芦丁供试品溶液的配制分别精密称取山竹花根、茎、叶粉末5 g(各3 份，编号a、b、c、d、e、f)，置于500 mL 圆底烧瓶中，加入200 mL 蒸馏水，沸水煎煮1 h，过滤，所余药渣加100 mL 蒸馏水继续煎煮45 min，合并两次煎液，用四层纱布过滤，抽滤，将所得滤液水浴蒸干，以60%乙醇溶解，并转移至50 mL 容量瓶，定容即得芦丁供试品溶液。

1.2.3.2 木犀草素供试品溶液(Ⅰ)的配制分别精密称取山竹花根、茎、叶粉末5 g(各3 份，编号a、b、c、d、e、f)，将其置于500 mL 索氏提取器中，向内加入200 mL 石油醚，浸泡12 h 后，70 ℃水浴加热提取至无色，放置至室温，旋转蒸干石油醚，加甲醇100 mL，超声提取30 min，将甲醇水浴蒸干，以100%甲醇溶解，并转移至10 mL 容量瓶中，定容即得木犀草素供试品溶液(Ⅰ)。

1.2.3.3 木犀草素供试品溶液(Ⅱ)的配制分别精密量取木犀草素供试品溶液(Ⅰ)中9 份溶液200 μL，向其中各加入1 滴稀硫酸溶液，摇匀后静置10 min，即得木犀草素供试品溶液(Ⅱ)。

1.2.4 测定方法分别精密吸取1.2.2、1.2.3 节配制所得的对照品溶液、供试品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪，按1.2.1 节色谱条件测定。

2 结果与讨论

2.1 专属性实验

2.1.1 芦丁分别吸取芦丁对照品溶液、供试品溶液各20 μL 注入高效液相色谱仪，按照1.2.1.1 节色谱条件测定，结果在供试品中芦丁与对照品色谱峰保留时间一致，并且能达到基线分离，见图3。

图3 山竹花样品色谱图Fig.3 Sample chromatogram

2.1.2 木犀草素分别吸取木犀草素对照品溶液、供试品溶液(Ⅰ)(Ⅱ)20 μL，注入高效液相色谱仪，按照1.2.1.2 节色谱条件进行测定，结果在供试品中木犀草素与对照品色谱峰保留时间一致，并且能达到基线分离，见图4。

图4 山竹花样品色谱图Fig.4 Sample chromatogram

2.2 线性关系的考察

2.2.1 芦丁精密量取1.2.2 节芦丁对照品溶液0.1，0.2，0.4，0.8，1.6 mL 至5 mL 容量瓶中，加入60%乙醇溶液定容至刻度，摇匀，即得。按上述色谱条件，分别进样20 μL，测定。以对照品进样浓度为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)分别绘制标准曲线，得芦丁线性回归方程为Y =16 232X +47.054，r=0.999 7(n=5)。结果表明，芦丁进样量在0.007 8 ～0.124 8 mg/mL 范围内线性关系良好。2.2.2 木犀草素精密量取1.2.2 节木犀草素对照品溶液0.05，0.1，0.2，0.4，0.8 mL 至5 mL 容量瓶中，用100%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。按上述色谱条件，分别进样20 μL，测定。以对照品进样浓度为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)分别绘制标准曲线，得木犀草素回归方程为Y =12 040X+11.358，r=0.999 1(n =5)。结果表明，木犀草素进样量在0.003 4 ～0.054 4 mg/mL 范围之内线性关系良好。

2.3 重复性实验

精密量取1.2.2 节芦丁、木犀草素对照品溶液各6 份(20 μL)，分别进样，测定峰面积。结果芦丁RSD 为0.003 5%，木犀草素RSD 为0.034 9%，表明二者重复性良好。

2.4 稳定性实验

精密量取芦丁、木犀草素对照品溶液，分别在0，2，4，8，12，24 h 各进样20 μL，分别测定两者的峰面积。结果芦丁RSD 为0.002 5%，木犀草素RSD为1.48%，表明二者均在24 h 内稳定。

2.5 加样回收率实验

取已知含量的山竹花叶b、e 供试品溶液各3份，精密量取b 溶液1 mL，加入芦丁对照品溶液100 μL;量取e 溶液400 μL，加入木犀草素对照品溶液100 μL，分别混匀即得供试样品。分别量取以上两种溶液各20 μL 进行测定，计算各自加样回收率。结果芦丁加样平均回收率为97.51%，RSD 为0.13%;木犀草素加样平均回收率为96.03%，RSD为0.54%。表明该样品制备方法准确性较高，可靠性较强。